天然免疫的古老家族成员Toll样受体2

天然免疫的古老家族成员Toll样受体2

Toll like receptor, Toll 样受体，可识别外源性微生物，并引发一系列信号转导， 促进炎性介质的释放，启动天然免疫反应。目前已发现的 TLRs 家族成员共有 10 多个，其中 TLR2 是目前已克隆人类 TLRs 家族中表达范围最广，识别病原微生物 及产物种类最多的分子，广泛的分布于单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、树突细 胞及上皮细胞和肿瘤细胞中。鉴于 TLR2 在天然免疫中的重要作用，深入研究该蛋 白具有重要的理论意义和现实意义。公司针对该蛋白研制出了 重组蛋白、抗体和 ELISA 检测试剂盒等一系列检测工具，供广大研究者使用。

通过蛋白结构分析得知，TLR2 为 I 型跨膜蛋白，其序列分为胞外段、跨膜段 和胞内段。由于 TLR2 胞外区含有 19 个 LRR 重复区域，通过抗原表位分析、蛋白 结构预测，以及蛋白可溶性分析后，选定 Pro47-Gly245 片段作为表达的 TLR2 重 组蛋白。该片段为胞外片段，方便有需要的研究者对该蛋白进行研究。根据 NCBI 中 NM_003264.3 的 CDS（编码 TLR 的核酸序列）设计引物，由于序列中有 EcoRI 酶切位点，在上下游引物中分别含有一个 BamHI 和一个 Xhol 的酶切位点，用于后 期重组载体的构建：

[PRIMER INFORMATION]

Upstream Primer:CGCggatccGAATCCTCCAATCAGGCTTCTCTG

Downsream Primer: CCGctcgagTCACAGTGCTGTCCTGTGACATTCCGAC

完成引物设计后，利用 PCR 技术获得片段为 600bp 的 DNA 片段。测序正确后， 采用传统的双酶切将扩增片段与自主构建的大肠杆菌表达载体进行连接，完成表达质粒的构建，测序结果如图 1 所示。

1 CCCTCAGGGCTCACAGAAGCTGTAAAAAGCCTTGACCTGTCCAACAACAGGATCACCTAC

61 ATTAGCAACAGTGACCTACAGAGGTGTGTGAACCTCCAGGCTCTGGTGCTGACATCCAAT

121 GGAATTAACACAATAGAGGAAGATTCTTTTTCTTCCCTGGGCAGTCTTGAACATTTAGAC

181 TTATCCTATAATTACTTATCTAATTTATCGTCTTCCTGGTTCAAGCCCCTTTCTTCTTTA

241 ACATTCTTAAACTTACTGGGAAATCCTTACAAAACCCTAGGGGAAACATCTCTTTTTTCT

301 CATCTCACAAAATTGCAAATCCTGAGAGTGGGAAATATGGACACCTTCACTAAGATTCAA

361 AGAAAAGATTTTGCTGGACTTACCTTCCTTGAGGAACTTGAGATTGATGCTTCAGATCTA

421 CAGAGCTATGAGCCAAAAAGTTTGAAGTCAATTCAGAATGTAAGTCATCTGATCCTTCAT

481 ATGAAGCAGCATATTTTACTGCTGGAGATTTTTGTAGATGTTACAAGTTCCGTGGAATGT

541 TTGGAACTGCGAGATACTGATTTGGACACTTTCCATTTTTCAGAACTATCCACTGGTTGA

图1 pUSCNK-1 hTLR2测序结果

将该序列与NCBI中TLR2的基因序列进行对比，相似性为100%。进一步证明 扩增序列的正确性。序列对比结果如图2

图2 核酸序列对比结果

之后，通过 IPTG 诱导重组蛋白体外表达，获得一个大小约 29KD 的重组蛋白， 基于表达获得的重组蛋白有 His 标签，后期纯化采用镍柱纯化，获得高纯度的重组 蛋白 TLR2，蛋白序列信息如图 3 所示，该蛋白的凝胶电泳图 如图 4 所示。

MGHHHHHHSGSEF- PSGL TEAVKSLDLS NNRITYISNS DLQRCVNLQA LVLTSNGINT IEEDSFSSLG SLEHLDLSYN YLSNLSSSWF KPLSSLTFLN LLGNPYKTLG ETSLFSHLTK LQILRVGNMD TFTKIQRKDF AGLTFLEELE IDASDLQSYE PKSLKSIQNV SHLILHMKQH ILLLEIFVDV TSSVECLELR DTDLDTFHFS ELSTG

图 3 蛋白序列信息

用纯化得到的重组蛋白，通过 SDS-PAGE（纯度>95%）免疫小鼠，获得小鼠 抗人 TLR2 的单克隆抗体，并采用亲和层析法获得高特异性的纯化抗体免疫家兔制备兔抗人 TLR2 的多克隆抗体获得纯化抗体后，通过 Western Blot 对其质量进行了一系列检验，结果如图 5 所示。

同时，我们还用人脾脏组织对 纯化的抗体进行了 IHC 验证（如图 6），结果显示在人脾脏组织中有 强阳性信号，且主要集中于细胞膜 上。以上实验进一步证明了抗人 TLR2 抗体的高特异性。

 Cloud-Clone Corp.还用获得的 高纯度蛋白以及高特异性的抗体 作 为 原 料 ， 自 主 研 制 出 图 6 IHC-P 检测结果 人 TLR2 蛋白定量检测试剂盒。

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