新的肿瘤标志物前梯度蛋白2(AGR2)

新的肿瘤标志物前梯度蛋白2(AGR2)

Anterior gradient protein 2 homolog (AGR2），前梯度蛋白 2，是一种分泌或定 位于内质网中的蛋白，主要表达于气管、肺、胃、小肠、结肠和前列腺等组织中， 其作用主要与粘蛋白 (Mucin 2）的合成与分泌相关，因此该蛋白在肿瘤相关研究 中受到较大重视。公司针对该蛋白研制出了蛋白、抗体和 ELISA 检测试剂盒等一系列相关检测工具，供相关研究者使用。

由于 AGR2 蛋白是一个只有 175 个氨基酸的蛋白，通过抗原表位及功能结构 域的分析，我们选取了去掉信号肽的全长蛋白序列（Arg21~Leu175）作为免疫原 的序列，这样不仅在免疫原的角度使该蛋白包含 AGR2 的所有抗原表位，同时选 取全长序列也可以方便对该蛋白研究有需求的研究者进行蛋白水平的研究。依据 uniport 中 O95994 所对应的蛋白及核酸序列设计引物如下，引物分别含有一个 EcoRI 的酶切位点和一个 XhoI 的酶切位点，用于后期重组载体的构建：

[ PRIMER INFORMATION ]

Upstream Primer: CGGAATTCAGAGATACCACAGTCAAACCTGGAG

Downstream Primer: CCGCTCGAGTTACAATTCAGTCTTCAGCAACTTG

完成引物设计后，通过模板对该蛋白的基因进行了克隆，PCR 获得一个 片段大小约为 450bp 的 DNA 片段。测序正确后，采用传统的双酶切法与 Cloud-Clone Corp.自主构建的大肠杆菌表达载体 pUSCNK-1 进行连接，并用 于后期的蛋白表达，测序结果如图 1 所示。

图1 pUSCNK-1 AGR2 测序结果

获得测序结果后，将其与 NCBI 序列比对发现，其与人 AGR2 的相似性为 100%，从而证明了扩增序列的正确性，序列比对结果如图 2。

图 2 核酸序列比对结果

此后，将表达质粒转化大肠杆菌，并经 IPTG 诱导重组蛋白表达，获得一个大 小约为 17KDa 的重组蛋白，由于表达蛋白连接有 His 标签，后期纯化采用了镍柱 纯化的方法，获得纯化的重组蛋白 AGR2,如图 3 所示。

然后，用该蛋白免疫小鼠制备出小鼠抗人 AGR2 的单克隆抗体，并采用亲和 层析的方法获得高特异性的纯化抗体，同时免疫兔获得兔抗 人 AGR2 的多克隆抗体。

获得纯化抗体后，通过 Western Blot 和 IHC 等方法对其质量进行了一系列检 测，结果如图 4、5 所示。在 Western Blot 中，我们检测了人结肠、小肠、胃组织 样本，结果显示为阳性，而大鼠肌肉组织样本结果显示为阴性，这样就验证了AGR2 表达的特异性。

此后，我们对纯化的单克隆抗体进行了 FITC 标记， 获得标记的抗人 AGR2 蛋白的抗体，并用人胃癌组织进行 了 IHC 检测，荧光显微镜下观察结果如图 6 显示。结果显示在人胃癌组织中有强 烈的荧光信号，且信号主要集中于胞浆中，从而证明了标记抗体的特异性和 FITC 标记的效率。

同时，在获得蛋白和抗体后，还研制出相应的 AGR2 蛋白定 量检测试剂盒。