细胞培养常见问答（二）

细胞培养常见问答（二）
26、PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之间有什么差别？
 
PFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白质的单克隆抗体生产培养基。如果作为杂交瘤生产培养基使用，PFHM-II可能需要补充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM即是杂交瘤生产培养基，也是单克隆抗体生产培养基。它包含低水平的蛋白质。
 
27、在High Five无血清培养基中去污剂的浓度是多少？ 
 
High Five无血清培养基中去污剂的浓度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。
 
28、High Five细胞用多大的密度冻存？
 
3.0x106 cells/ml
 
29、在我的果蝇培养基中发现形成白色沉淀，加热后溶解。它是什么？对我的细胞有害吗？
 
可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培养基中谷氨酰胺的浓度比典型的2 mM高6倍。酪氨酸的浓度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加难以溶解。沉淀也可能是不止一种成分的复合物。它可能是由于贮存在局部温度较低的地方引起。只要沉淀在培养条件下可以溶解，对实验不会有不利的影响。
 
30、如何从T25瓶中转移sf9细胞？能用胰蛋白酶消化吗？
 
我们强力推荐使用脱落细胞的方法，因为这项技术破坏性最小，生活力最高。正如手册上所显示，通过使用巴氏德吸液管，让细胞上培养基流动。作为一种选择你也可以轻轻拍打培养瓶。只有在绝对必要的情况下，才使用胰酶消化细胞。 胰酶消化一个T25瓶的sf9细胞：

1.  去除培养基。

2.  用2ml 1xPBS（足以覆盖细胞表面）洗涤细胞，去除PBS。

3.  加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆盖细胞表面）。

4.  37 ℃孵育5到10分钟。在仪器下检测看到5分钟后它们正在向上移动。

5.  向细胞中加入2ml 细胞培养液，移入锥形管，用2ml培养液洗瓶壁，移入同一锥形管中。（培养基中的FBS终止了胰酶的活性。）

6.  离心（1100rpm）沉淀细胞。去除培养基。

7.  用新的培养基重新悬浮细胞。传代。
 
31、在Sf9, Sf21, 和high Five细胞悬浮培养时，肝素的使用量是多少？
 
为了防止悬浮培养细胞聚集的形成，使用肝素浓度为10单位/毫升细胞悬液。
 
32、如何评估ES细胞合格的胎牛血清？
 
使用D3 ES细胞。这是一个对于胎牛血清中生长促进、生长抑制和分化因子非常敏感的细胞系。 相关生长效率分析： 当ES细胞以非常低的密度传入包含10％胎牛血清的生长培养基中，检测开始和支持ES细胞克隆的能力。 细胞毒分析： 当以非常低的密度传入包含30％胎牛血清的生长培养基中，检测ES细胞和feeder细胞的生长能力。 相关形态学和分化分析： 检测胎牛血清支持未分化ES细胞克隆的能力。通过碱性磷酸酶活性评估分化程度。未分化的ES细胞小颜色深红粉红，分化的细胞较大，丰满，颜色较浅。 所有的分析在没有ESGRO的情况下进行的，培养基中出现ESGRO会掩盖由胎牛血清所导致的问题。（ESGRO或LIF经常用来保持ES细胞处于未分化状态。） 经过培养发现，大约8批中有1批可以用来培养ES细胞。
 
33、在重新冻存sf9细胞前，它可以传多少代？随着传代的次数的增加，它的感染能力会降低吗？
 
通常情况当细胞经过30次传代后，应该返回冻存。无论什么时候记数时，都应该检查细胞活力。如果超过95％的细胞保持有活力和在大约30小时左右加倍，细胞仍然可以使用。如果活力和加倍时间下降，它们的感染力将不在是有效的。
 
34、如何选用特殊细胞系培养基？
 
培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始。
 
35、何时须更换培养基？
 
视细胞生长密度而定， 或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。
 
36、可否使用与原先培养条件不同之培养基？
 
不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基， 若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基， 细胞大都无法立即适应， 造成细胞无法存活。
 
37、可否使用与原先培养条件不同之血清种类？
 
不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清， 在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。
 
38、何谓FBS, FCS, CS, HS ?
 
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思， 两者都是指胎牛血清， FCS 乃错误的使用字眼， 请不要再使用。CS (calf serum) 则是指小牛血清。HS (horseserum) 则是指马血清。
 
39、培养细胞时应使用5 % 或10% CO2？或根本没有影响？
 
一般培养基中大都使用HCO3 -/CO3 2-/H+ 作为pH 的缓冲系统， 而培养基中NaHCO3 的含量将决定细胞培养时应使用的CO2 浓度。当培养基中NaHCO3 含量为每公升3.7 g 时，细胞培养时应使用10 % CO2；当培养基中NaHCO3 为每公升1.5 g 时， 则应使用5 % CO2 培养细胞。
 
40、Hank's 平衡盐溶液(HBS)要在空气中使用，不需要CO2培养箱。原因是什么？Hank's 平衡盐溶液(HBS)和Earle's平衡盐溶液(EBS)有什么本质的功能差别？
 
HBS和 EBS 的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在Eagles (2.2 g/L)中比在Hanks (0.35 g/L) 中高。碳酸氢钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的PH值。Eagles液在空气水平的CO2 中，溶液会变碱，Hanks液在CO2培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。
 
41、细胞之接种密度为何？
 
依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。
 
42、悬浮性细胞应如何继代处理？
 
一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中， 稀释细胞浓度即可， 若培养液太多时， 可将培养角瓶口端稍微抬高， 直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶， 加入新鲜培养基稀释至适当浓度， 重复前述步骤即可。
 
43、冷冻管应如何解冻？
 
取出冷冻管后， 须立即放入37 °C 水槽中快速解冻， 轻摇冷冻管使其在1 分钟内全部融化， 并注意水面不可超过冷冻管盖沿， 否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时， 必须注意安全， 预防冷冻管之爆裂。
 
44、细胞冷冻管解冻培养时， 是否应马上去除DMSO？
 
除少数特别注明对DMSO 敏感之细胞外， 绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞）， 在解冻之后， 应直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中， 待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO 即可， 如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。
 
45、附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？
 
一般使用之trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53 mMEDTA.4 Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于-20 °C，避免反复冷冻解冻造成trypsin 之活性降低， 并可减少污染之机会。
 
46、欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？
 
欲回收动物细胞， 其离心速率一般为300xg (约1,000 rpm)，5 - 10 分钟， 过高之转速， 将造成细胞死亡。
 
47、细胞冷冻培养基之成份为何？
 
动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能， 故不可将DMSO 直接加入细胞液中， 必须使用前先行配制完成。
 
48、DMSO 之等级和无菌过滤之方式为何？
 
冷冻保存使用之DMSO 等级， 必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)， 其本身即为无菌状况， 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中， 保存于4 °C， 避免反复冷冻解冻造成DMSO 之裂解而释出有害物质， 并可减少污染之机会。若要过滤DMSO， 则须使用耐DMSO 之Nylon 材质滤膜。
 
49、冷冻保存细胞之方法？
 
冷冻保存方法一: 冷冻管置于4 °C 30~60 分钟→ (-20 °C30 分钟*) → -80 °C 16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。
 
冷冻保存方法二: 冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降1-3 °C 至-80 °C 以下， 再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20 °C 不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80 °C 冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。
 
50、细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？
 
冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial， 融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。
 
51、培养基中是否须添加抗生素？
 
除于特殊筛选系统中外， 一般正常培养状态下， 培养基中不应添加任何抗生素。
 
52、应如何避免细胞污染？
 
细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。、
 
53、如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？
 
原则上：直接灭菌后丢弃之。
当重要的培养污染时，研究者可能试图消除或控制污染。首先，确定污染物是细菌、真菌、支原体或酵母，把污染细胞与其它细胞系隔离开，用实验室消毒剂消毒培养器皿和超净台，检查HEPA过滤器。
 
高浓度的抗生素和抗霉菌素可能对一些细胞系有毒性，因而，做剂量反应实验确定抗生素和抗霉菌素产生毒性的剂量水平。这点在使用抗生素如两性霉素B和抗霉菌素如泰乐菌素时尤其重要。下面是推荐的确定毒性水平和消除培养污染的实验步骤。
 
1）在无抗生素的培养基中消化、计数和稀释细胞，稀释到常规细胞传代的浓度。
 
2）分散细胞悬液到多孔培养板中，或几个小培养瓶中。在一个浓度梯度范围内，把选择抗生素加入到每一个孔中。例如，两性霉素B推荐下列浓度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0，8.0 mg/ml。
 
3）每天观测细胞毒性指标，如脱落，出现空泡，汇合度下降和变圆。
 
4）确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2～3倍浓度的抗生素的培养液培养细胞2～3代。
 
5）在无抗生素的培养基中培养细胞一代。
 
6）重复步骤4。
 
7）在无抗生素的培养基中培养4～6代，确定污染是否以已被消除。
 
54、支原体(mycoplasma) 污染的细胞， 是否能以肉眼观察出异状？
 
不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株， 无法以其外观分辨之。
 
55、支原体污染会对细胞培养有何影响？
 
支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数， 代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。
 
56、侦测出细胞株有支原体污染时， 该如何处理？
 
直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。
 
57、CO2 培养箱之水盘如何保持清洁？
 
定期(至少每两周一次) 以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。
 
58、为何培养基保存于4 °C 冰箱中， 颜色会偏暗红色， 且pH值会越来越偏碱性？
 
培养基保存于4 °C 冰箱中， 培养基内之CO2 会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂(通常为phenol red) 的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果， 将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时， 可以通入无菌过滤之CO2， 以调整pH 值。
 
59、各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？
 
不同厂牌的dish 或flask， 其所coating 的polymer 不同， 制造程序亦不同， 虽对大部分细胞没有太大之影响， 惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之dish 或flask 而有显著之生长差异。
 
60、购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？
 
研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少， 大都是因为离心过程操作上的失误， 造成细胞的物理性损伤， 以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心， 应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。
 
61、购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？
 
研究人员在细胞培养时出现存活率不佳， 常见原因可归纳为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后， 加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于-80 °C 太久。
 
62、贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基，在放置几天后颜色变紫?
 
这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时，碳酸氢纳导致了pH值的上升。您可以在使用前松开瓶口，在CO2培养箱孵育培养基10-15分钟，来校正溶液的pH值（确定松开瓶口以保证气体交换）。
 
63、 细胞培养基偶然被冻，可否继续使用？
 
如果细胞培养基偶然被冻，您应该熔化培养基并观察是否有沉淀产生。如果没有沉淀产生，培养基可以正常使用，如果出现沉淀，只能丢弃这些培养基。

64、无血清培养与有血清培养使用的抗生素量一样吗？
 
当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到毒性水平。

65、培养基中添加了血清和抗生素后，可长期保存吗？
 
一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。
 
66、培养基及其它添加物和试剂可反复冻融吗？
 
大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。
 
67、为什么要在溶解的一周内使用贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液?
 
胰蛋白酶在4℃就可能开始降解，如果在室温下放置超过30分钟，就会变得不稳定。
 
68、保存血清最好的方法?
 
我们建议血清应保存在-5 ℃至-20 ℃。若存放于4℃时，请勿超过一个月。若一次无法用完一瓶，建议无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。
 
69、如何解冻血清才不会使产品质量受损?
 
将血清从冷冻箱取出后，先置于2～8 ℃冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。