细胞污染的首要威胁是什么，如何检测？

             细胞污染的首要威胁是什么，如何检测？

细胞污染是世界细胞库面临且长期存在的一大问题。每年都会由于细胞污染导致数万美元的损失。

而在这些污染之中, 支原体污染是首要威胁。支原体是广泛存在于自然界中能独立生活的最小微生物, 直径300~800 nm, 能在细胞内繁殖, 且细胞壁的缺乏使其对常见抗生素如青霉素和链霉素具有更高的耐受性, 其灵活、小规模和多态性使它更容易透过0.22~0.45 μm滤膜。自1956年Robinson等第一次报道支原体污染以来, 世界各地实验室细胞库开始重视并检测细胞中是否存在支原体污染。有文献指出, 细胞培养过程中, 支原体感染发生率高达30%~60%。因此, 及时、准确地检测出所培养的细胞是否有支原体污染至关重要。污染细胞的支原体主要有人源、猪源和牛源三类, 大部分是发酵支原体(Mycoplasma fermentants)、猪鼻支原体(M. hyorhinis)、口腔支原体(M. orale)、精氨酸支原体(M. arginini)、梨支原体(M. pirum)、唾液支原体(M. salivarium)、莱氏无胆甾支原体(Acholeplasmalaidlawii)和人型支原体(M. hominis)。

支原体污染会影响细胞的形态、功能、代谢、细胞膜、生长速率、诱导染色体畸变、细胞内信号传导等各种细胞特性。受支原体污染的细胞在培养时培养基的pH值不会发生改变, 也不会浑浊,因此, 很难直接观察出细胞是否受到污染。常用的支原体检测方法有培养法、DNA荧光染色法、酶联免疫吸附法和PCR法等。

1. 培养法

培养法是最传统的检测方法, 该方法能直观地显示是否存在支原体污染。将细胞培养物置于PPLO肉 汤 培 养 基(pleuropneumo-nia-like organismsbroth base)中, 37 °C培养3天后离心, 将沉淀物转移至PPLO琼脂培养基相同条件下培养4~6周, 观察是否有“煎鸡蛋”样菌落出现, 若有即为支原体污染。

这种方法简单易行, 但耗时比较长, 且存在不少缺陷。支原体由于遗传缺陷, 导致某些代谢途径缺失, 其生长很大程度依赖于培养基的成分。在
配制培养基时, 任何成分质量或批次的不同都会影响支原体的生长, 从而影响检测的灵敏度。不同的生长条件(如好氧、厌氧、微氧等)也会影响检测结果, 易导致假阳性。此外, 还有许多支原体无法培养, 因此, 使用培养法的检测结果并不全面。

2. DNA荧光染色法

DNA荧光染色法是基于使用荧光染料DAPI或Hoechst 33258的细胞化学染色法。荧光染料能选择性的结合细胞和支原体DNA的小沟, 因此, 在准备过程中, 任何存在的DNA均会被染色且DNADAPI复合物吸收波长为340~488nm。将待测细胞单层培养至70%~90%汇合度时, 用细胞刮刀收取, 以5×104/mL~1×105/mL浓度转接至盖玻片上培养12~24小时, 用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤, 并在37 °C下用DAPI-甲醇溶液染色15分钟, 无菌水洗涤
并烘干后置于柠檬酸缓冲液(pH5.5)׃甘油(2׃1)条件中, 用指甲油密封。处理后的玻片置于荧光显微镜下观察, 被支原体污染的细胞经染色后, 细胞核外与细胞周围可看到许多大小均一的荧光点。

3. ELISA法

酶促反应作为生物化学检测手段可应用于培养细胞中支原体的检测, 如通过测乙酸激酶、氨基甲酸激酶等各类酶的活性, 能快速、灵敏地对
细胞培养物进行筛选检测。酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbnentassay, ELISA)试剂可通过商业渠道购买, 其中包括针对细胞培养过程中常见支原体/胆甾原体抗原的多克隆抗体。用于检测的抗体与生物素共轭结合后, 链霉亲和碱性磷酸酶水解4-硝基苯基磷酸生成黄色的硝基苯酚产物, 在405 nm波长下通过酶标仪量化。ELISA检测支原体污染有较好的特异性和敏感性, 最显著的优点是能一次检测大量样品。

4. 基于DNA聚合酶链式反应(PCR)的扩增检测

PCR技术是根据DNA高温变性、低温退火、适温延伸的原理进行的扩增技术。自Uemori等公布了12种支原体16S-23S rRNA区域的序列后, 应用PCR技术进行支原体检测的研究迅速发展。16S、16S-23S、23S rRNA是支原体基因组内的保守区域, 根据这些区域的序列设计特异性引物, 使用PCR的方法扩增后, 利用琼脂糖凝胶电泳进行检测, 通过比对分析扩增产物的大小, 可进行支原体感染的初步分析鉴定。PCR检测法与传统培养或荧光染色技术相比,
具有快速、稳定、易重复及灵敏度高等特点。但易受其他污染物如细菌、真菌影响导致假阳性结果, 且仍处于实验室研究阶段, 尚无标准、准确的一套检测方案。