养细胞需要注意的细节有哪些？

养细胞需要注意的细节有哪些？

   养细胞可谓是个精细活，从事养细胞的人都知道养细胞的时候一旦不注意，就很容易造成细胞污染，所以想要养好细胞除了小心谨慎以外，还要提前做好准备：
       细胞培养前的准备
       1）在带上手套开始细胞培养之前,先检查一下移液管和瓶子的数量是否充足,以免在开始实验后再次出入操作台，这样可以降低细胞污染的风险。
       2）细胞培养基也应先预热,选择只预热部分培养基而非整瓶加热,不但可以节约实验时间,而且可以避免因反复加热培养基而造成的蛋白质降解。

       3）结束操作后,别忘了培养基对光敏感,应尽可能避光保存。

       细胞培养的定期检查
       1）定期检查培养细胞的形态，即形状和外观，对于细胞培养实验取得成功至关重要。
       2）除确认细胞的健康状态外，每次操作细胞时通过肉眼和显微镜检查细胞还可早期发现污染征象，避免污染扩散至实验室其他细胞。
       细胞变质的征象
       1）细胞变质的征象包括核周出现颗粒、细胞与基质解离以及细胞质空泡形成。
       2）这些变质征象可能为多种原因所致，例如：培养物污染、细胞系衰老或培养基中存在毒性物质，或者这些征象仅表明培养物需要更换培养基。

       3）变质严重时将会成为不可逆的变化。

       细胞培养通风橱的消毒及布局
       1）保持细胞培养通风橱内的整洁有序，将所有物品置于直视范围内。
       2）向放入通风橱内的所有物品喷洒70%乙醇，擦拭清洁进行消毒。
       3）在通风橱中部开阔处放置细胞培养容器；移液器置于右前方易于取用；试剂和培养基置于右后方便于吸取；试管架置于中后部；小型容器置于左后部用于盛放废液。
       培养瓶/皿等物品的无菌操作
       1）无菌培养瓶、试剂瓶、培养皿等物品使用时方可揭开盖子，不得将其开放暴露于环境中，操作完成后尽快盖上盖子，取下盖子时应将盖子开口朝下放在工作台面上。
       2）进行无菌操作时不要说话、唱歌或吹口哨。尽快完成实验，以尽量避免污染。
       细胞培养中可能的污染物
       1）细胞培养污染物主要分为两类：
        a.化学污染物,如培养基、血清和水中的杂质、内毒素、增塑剂和去污剂。
        b.生物污染物，如细菌、霉菌、酵母、病毒、支原体以及其他细胞系的交叉污染。
        c.可通过充分了解污染源以及采用良好的无菌技术，降低污染发生的频率和严重程度。
        交叉污染的确认
        1)交叉污染虽不如微生物污染普遍，但与HELA细胞及其他生长迅速的细胞系间广泛的交叉污染是个明确的问题，会造成严重后果。
        2)从声誉好的细胞库获取细胞系、定期检查细胞系性质及采用良好的无菌技术有助于避免交叉污染。
        3)通过DNA指纹图谱、核型分析和同位素分析可确认有无交叉污染。
        细胞换液注意事项
       1)为细胞换液时，要沿着培养瓶的一侧轻轻地加入，而不是直接加到细胞中，以免损伤细胞，当培养的细胞株较为脆弱时尤其需要注意。
       2)使用无菌玻璃吸管或一次性塑料吸管和移液器操作液体时，每支吸管只能使用一次，以免交叉污染。
       细胞传代的时间把握
       1)当细胞呈指数增殖，贴壁培养的细胞已占据所有可用基质、没有扩增空间，或悬浮培养的细胞已超过培养基质所支撑的能力，无法进一步生长时，细胞增殖速度将大大降低甚至完全停止。
       2)为了将细胞密度维持在最佳水平，以便细胞继续生长，并且刺激进一步增殖，必须对细胞进行传代。
       细胞培养中使用抗生素的注意事项
      1)细胞培养时不应长期使用抗生素，因为连续使用抗生素会促进抗生素耐药性细胞株的产生，导致轻度污染持续存在。
      2)抗生素只能作为对付污染的最后手段短期使用，并尽快撤除。
      3)如果长期使用抗生素，则应同时进行无抗生素培养，以便作为鉴别隐性感染的对照。
       细胞冻存的必要性
       1)连续培养的细胞系容易发生遗传漂变，有限细胞系最终会发生衰老，所有培养的细胞都易受到微生物污染，即使运转情况最好的实验室也会遇到设备故障的问题。

       2)由于已建立的细胞系是一种宝贵资源，更换细胞系成本高昂，而且耗费时间，因此，必须将其冷冻起来，长期保存。

       细胞冻存的事项
       1)应在细胞浓度高的情况下进行细胞培养冻存，并且细胞传代的次数尽可能少。
       2)在冻存前确保活细胞的百分比至少为90%。请注意，最佳冻存条件取决于所用细胞系。
       3)冻存和复苏过程对大多数细胞都会造成不利影响，因此不要通过涡旋震荡或者用力敲打培养瓶的方法使细胞脱落（培养昆虫细胞时除外），也不要高速离心细胞。
       冻存培养基的选择
       1)冻存细胞时必须选择冻存培养基，冻存培养基中应含有DMSO或者甘油等冷冻保护剂。
       2)还可使用专门配制的完全冻存培养基，例如HyClone、Gibco的细胞冻存培养基。
       细胞培养温度的设定
      1)细胞培养的最佳温度主要取决于细胞供体的体温，此外也受到解刨部位体温差异的影响，例如：皮肤温度低于骨骼肌的温度。
      2)与温度过低相比，细胞培养时温度过高时更为严重的问题：因此，往往将培养箱的温度设定为略低于最佳温度。
      各类细胞培养的最佳温度
      1)大多数人和哺乳动物细胞系在36℃~37℃下具有最佳生长状态。
      2)昆虫细胞在27℃具有最佳生长状态；在低于27℃以及27至30℃范围内，细胞生长较慢。
      3)温度超过30℃时，昆虫细胞活力降低，即使温度降至27℃，细胞活力也无法恢复。
      4)禽类细胞系在38.5℃时具有最佳生长状态。虽然此类细胞也可在37℃下培养，但其生长速度会变慢。
      5)来源于冷血动物（例如：两栖动物、冷水鱼）的细胞系可耐受很宽的温度范围，为15-26℃。
      6)请注意每种细胞的培养条件均有所不同，偏离某种细胞所需的培养条件会导致细胞表型异常，甚至培养完全失败。
       细胞培养的最适pH
       1)大多数正常的哺乳动物细胞系都能在pH值为7.4的环境中生长良好，而且不同细胞株间差异极小。
       2)但是，目前发现有些转化细胞系在轻度偏酸性的环境中即pH7.0-7.4时生长较好，而有些正常的成纤维细胞系更适合轻度偏碱性的环境即pH为7.4-7.7。
       3)Sf9和Sf21等昆虫细胞系最适合在pH值为6.2的环境中生长。
        细胞培养基最适pH的控制
       1)细胞培养基可控制培养体系的pH值，为培养的细胞缓冲pH值的变化。这种缓冲作用通常是通过添加有机缓冲盐（例如：HEPES）或者二氧化碳-碳酸氢盐缓冲盐实现。
       2)由于培养基的pH值取决于溶解态二氧化碳与碳酸氢盐间的精密平衡，因此空气中二氧化碳含量的变化会改变培养基的pH值。
       3)为此，使用二氧化碳-碳酸氢盐缓冲盐培养基时必须使用外源性二氧化碳，特别是使用开放式培养皿培养细胞或者进行高浓度的转化细胞系培养时。
        细胞培养中血清的保存
        1)细胞培养中所用的血清不尽相同，您需要根据您所培养的细胞种类和培养要求来挑选出最适合的血清。建议将血清保存在-10至-20℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。若无法一次用完一瓶，建议您将血清无菌分装至合适体积的灭菌容器内，再放回冷冻箱保存。
       2)解冻血清时，建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于2-8℃冰箱过夜融解，然后在室温下使之全融。需要注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。
        如何在细胞铺板时避免“边缘效应”
        1)细胞实验铺板时，为避免“边缘效应”，以应用96孔板的中间60孔为最佳，一般四周的一圈边缘孔不养细胞，只做空白或阴性对照。
        2)铺板时，细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来而导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就再混匀一下。
        3)加样器操作要熟练，尽量避免人为误差。此外，吹散次数过多也会影响细胞活力。所以要熟练操作，尽快上板。
        何时选择使用热灭活血清
        1)加热血清可以灭活补体系统。
        2)启动的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，启动淋巴细胞和巨噬细胞活化。
        3)在免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。
         热灭活血清可能出现的现象
         1)在免疫学研究、培养ES细胞、昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。而对于其他大多数的细胞来说是不需要热灭活血清的。
         2)热灭活血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至可能因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低；经过热处理的血清，沉淀物会显著地增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37度环境中，又会使此沉淀物增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。
         3)根据自己的研究需要是否需要热灭活血清。如此一来，不但能确保血清的质量，而且能够节省实验时间。
         如何正确热灭活血清
         1)热灭活时请将血清置于56℃水浴30分钟。
         2)为尽量减少热灭活对血清品质的影响，一次灭活的血清体积不宜过大。

         3)最好准备同样的容器装相等体积的水（与血清相同温度），灭活时将装有血清和水的容器同时放入56℃水浴，在装水的容器中放置温度计，加热过程中不时地轻轻旋转混匀血清，当温度计显示达到56℃左右，开始计时。