钰博生物文献：外泌体内的miR-221通过靶向调控DNM3促进神经胶质瘤恶性进展和化疗抵抗

外泌体内的miR-221通过靶向调控DNM3促进神经胶质瘤恶性进展和化疗抵抗

摘要：脑胶质瘤在中枢神经系统中高发,且预后很差。即使给予术后放疗、化疗或联合治疗,脑胶质瘤患者的复发率仍然很高,治疗效果始终不能令人满意。随着基因水平研究的不断深入,有关胶质瘤的基因分子机制得到深入的探索。O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyhransferase,MGMT)启动子甲基化、1p/19q杂合性缺失、异柠檬酸脱氢酶1(Isocitrate dehydrogenase 1,IDH1)基因突变、ATRX表达缺失等均已经成为胶质瘤病理学诊断的重要分子生物学标记,也丰富了人们对于肿瘤基因变异的认识。Stephen Paget于1889年提出肿瘤生长的“种子-土壤”学说,奠定了肿瘤微环境的概念。外泌体是肿瘤微环境中的重要成分。它通过释放自身携带的细胞因子参与了肿瘤的发生、增殖、侵袭和化疗抵抗等生物学过程。而肿瘤细胞来源的外泌体(Tumor cells derived exosome,Texo)由于它的结构特征和运输功能已经成为近年来肿瘤领域的研究热点。2013年,美国、德国3位科学家凭借他们所发现的细胞囊泡运输的调节机制,荣获2013年诺贝尔生理学或医学奖。外泌体(exosome)作为人体内一类重要运输囊泡,也开始受到越来越多的关注。科学家们已发现,外泌体会参与到肿瘤细胞的生长、增殖、侵袭、凋亡、血管生成、炎症反应、免疫应答等重要的生物过程,细胞会通过分泌外泌体,将一些信号分子分泌到较远的组织或细胞中,以起到调控作用。外泌体作为药物传递系统(Drug delivery system,DDS)为高效药物投递提供天然的内源性纳米级载体,其靶向作用的潜力也逐渐被发现。miRNA是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA,可以与靶mRNA的3’非翻译区(Untranslated Regions,UTR)结合从而在转录后水平调节靶基因的表达。有研究显示,miR-221在直肠癌、胰腺癌、乳腺癌和膀胱癌中是一种促癌基因。利用高通量筛选测序平台筛选脑胶质瘤组织miRNA差异表达情况,筛选出了胶质瘤组织内miR-221高表达,特别是胶质母细胞瘤组织。考虑到胶质瘤细胞外泌体内miR-221的表达情况以及调节机制尚未进行过研究,故在本实验中我们选取胶质瘤细胞来源的外泌体miR-221作为研究对象,进行体内外细胞和外泌体miR-221表达的检测,并通过CCK-8实验,流式细胞技术以及Transwell实验探讨其对于胶质瘤的作用。然后进一步寻找miRNA的靶基因。DNM3(Dynamin 3)是发动蛋白超家族(包括DNM1、DNM2、DNM3)中的一员,参与许多膜转运功能,例如胞质分裂、吞噬作用、转运囊泡出芽和细胞流动等。最近的研究表明,DNM3的高表达可抑制细胞增殖及诱导凋亡。基于对目前已有文献的充分分析,我们推测miRNA-DNM3途径有可能成为抑制神经胶质瘤生长及放化疗增敏的治疗靶点。由于DNM3出现在Targetscan的预测结果中,我们进一步研究其与miR-221的关系。实验中我们确定了miR-221的靶基因DNM3以及miR-221的转录调控因子RELA,并通过双荧光素酶报告基因实验得以证实,并分析它们表达量的相关性,最后通过病毒转染实验证实miR-221对胶质瘤的作用是通过靶向调控DNM3引起的,并受上游RELA的转录调控。第一部分miR-221在人脑胶质瘤组织和GBM源性外泌体内的表达及其与胶质瘤WHO病理分级的关系目的:研究miR-221在人脑胶质瘤组织和GBM源性外泌体内的表达,并分析miR-221的表达与胶质瘤WHO病理分级的关系。方法:1 48例胶质瘤患者及11例非肿瘤患者组织标本均于2015年采集自河北医科大学第二医院神经外科。包括23名女性,36名男性,年龄从30至68岁。标本采集后迅速放至液氮中冷冻,然后-80℃低温保存。诊断结果均由2位病理医师根据WHO分级指导得出。2抽取上述患者的静脉血,室温静置后获得血清或者采集后立即离心获得血浆上清液,提取外泌体。3 SHG-44、U87MG、HEB和U251的培养,及细胞外泌体的提取。4定量反转录聚合酶链反应(qRT-PCR)方法测定神经胶质瘤组织或外泌体内miR-221含量。5应用t检验分析神经胶质瘤中miR-221含量与胶质瘤级别或不同细胞系之间的关系。结果:1 miRNA-221在人脑胶质瘤组织中表达上调:与对照组织比较,胶质瘤组织中miRNA-221均呈高表达(P<0.01),其中高度恶性胶质瘤组织中miRNA-221表达量均明显高于低度恶性者(P<0.01)。在WHO III和WHO IV胶质瘤中表达量较WHO II或非肿瘤组织明显增高(P<0.01)。miR-221的表达与胶质瘤的病理分级(WHO分级)明显相关。2比较在无细胞的血清和血浆外泌体内miR-221的差异表达,可见胶质瘤患者与非肿瘤患者miR-221表达量具有显著性差异(P<0.01)。3血浆中的检测结果与组织检测结果相似:胶质瘤患者(n=48)与非肿瘤患者(n=11)相比,血浆外泌体miR-221表达量具有显著性差异(P<0.01)。胶质瘤患者血浆外泌体miR-221表达量随胶质瘤病理级别升高表达量显著升高。4 miR-221在四种胶质瘤细胞系中均高表达,且miR-221在U87MG细胞来源的外泌体中表达最高,U251、SHG-44、HEB细胞外泌体内表达依次降低。结论:1 miR-221在人脑胶质瘤组织中高表达,在血浆来源或胶质瘤细胞系来源的外泌体内也存在高表达,且其表达量随着胶质瘤WHO病理分级呈递增趋势。高级别(III和IV级)胶质瘤miR-221的表达量明显高于低级别(II级)胶质瘤,差别具有统计学意义。2 miR-221的表达量与胶质瘤WHO病理分级呈显著的正相关,预示外泌体miR-221可能用于胶质瘤相关的临床检测。第二部分U87MG细胞源性的外泌体miR-221对SHG-44细胞生物学活性的影响目的:研究U87MG细胞源性外泌体miR-221对SHG-44细胞的增殖、侵袭、化疗抵抗等方面的影响。方法:1培养U87MG和SHG-44细胞系,提取U87MG细胞系外泌体。2向SHG-44细胞系转染anti-miR-221(miR-221 ASO)以降低细胞内miR-221的表达,转染anti-miR-NC(Ctrl ASO)作对照。实验组SHG-44细胞培养基中同时加入外泌体。3进行CCK-8实验研究降低miR-221表达后胶质瘤细胞增殖能力的变化。4进行流式细胞实验研究降低miR-221表达对胶质瘤细胞凋亡能力和替莫唑胺耐药的变化。5进行Transwell实验和划痕实验研究降低miR-221表达后胶质瘤细胞侵袭能力的变化。结果:1 qRT-PCR结果显示,转染anti-miR-221后,SHG-44细胞内miR-221的表达量显著降低(P<0.01)。2 CCK-8实验结果显示,anti-miR-NC+Exo组的增殖活力最高,anti-miR-221组的增殖活力最低,即敲低miR-221的表达后,胶质瘤细胞SHG-44的增殖能力显著降低(P<0.01)。3流式细胞实验结果显示,敲低miR-221表达后,SHG-44细胞凋亡能力无明显改变,但是对替莫唑胺的敏感性显著增高(P<0.01)。4 Transwell实验和划痕实验结果显示,敲低miR-221表达后,SHG-44细胞侵袭能力显著降低(P<0.01)。结论:敲低miR-221表达,可以使SHG-44细胞增殖及侵袭能力显著降低,凋亡能力虽无改变,但是对替莫唑胺的敏感性增高。miR-221可以影响胶质瘤细胞的增殖、侵袭及对替莫唑胺的化疗耐药。第三部分miR-221对下游靶基因DNM3的调控以及RELA对miR-221转录能力的影响目的:寻找miR-221的下游作用靶点以及miR-221的转录调控因子,深入了解miR-221对胶质瘤生物学影响的作用机制。方法:1使用Targetscan数据库预测miR-221的下游作用靶点,并搜集相关文献筛选有意义结果。2构建miR-221过表达慢病毒质粒,建立miR-221过表达稳定SHG-44细胞系,进行稳定细胞系的筛选。3双荧光素酶报告基因检测用于验证miR-221与DNM3的作用关系。4应用qRT-PCR及蛋白质印迹(Western blot)方法检测miR-221与DNM3在SHG-44细胞中的表达量,并分析表达量的相关性。5通过CCK-8实验、流式细胞术、Transwell迁移和侵袭实验等方法,研究上调DNM3对胶质瘤SHG-44细胞增殖、侵袭和凋亡等生物学行为的影响。6通过生物信息学方法,预测miR-221启动子区域的转录因子结合位点;利用荧光素酶报告实验,在SHG-44细胞中验证此转录因子与miR-221启动子的结合情况;通过上调或下调这一转录因子,采用实时定量PCR方法检测miR-221的表达变化。结果:1根据Targetscan的预测结果,并结合相关文献资料,发现DNM3上存在两个与miR-221的作用靶点。2成功构建了miR-221过表达慢病毒载体和稳转胶质瘤细胞系,miR-221的表达水平显著升高(P<0.01),是对照组的45.5倍。3双荧光素酶报告检测结果表明,相对于miR-NC,miR-221可以显著抑制荧光素酶的活性(P<0.01),而在突变靶位点后此现象消失(P<0.01)。4 qRT-PCR检测胶质瘤组织中的DNM3表达量:DNM3表达量随胶质瘤病理级别升高表达量反而降低。Spearman秩相关分析表明,胶质瘤细胞DNM3与miR-221的表达量呈负相关(Spearman r=-0.908,P<0.01)。5转染miR-221过表达载体后,在高表达miR-221的细胞中,DNM3低表达;CCK-8实验提示,增加DNM3的表达后,细胞增殖能力显著降低。流式细胞技术检测发现,加入替莫唑胺后,DNM3促进了胶质瘤细胞的早期凋亡(P<0.01)。Transwell实验和划痕实验结果表明,转染DNM3能够抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭能力。6通过生物信息学方法,预测到miR-221编码基因的启动子区域存在RELA的结合位点;双荧光素酶报告基因检测证实RELA能够与miR-221基因的启动子区域相结合;实时定量PCR结果表明,转染RELA后,能诱导miR-221的过表达。结论:DNM3的mRNA中存在miR-221在胶质瘤中的靶向作用位点,转录因子RELA调节miR-221基因的转录。第四部分miR-221促进SHG-44人脑胶质瘤细胞系生长的体内研究目的:动物体内证实miR-221对胶质瘤生物学活性影响。方法:1稳定转染miR-221的SHG-44胶质瘤细胞系,进行稳定细胞系的筛选,对照组转染miR-NC。2应用反转录定量聚合酶链反应(qRT-PCR)方法检测miR-221在SHG-44细胞中的表达量。3裸小鼠皮下人脑胶质瘤模型的建立。4肿瘤生长情况观察:每隔4天用游标卡尺测量一次肿瘤的长径(a)及宽径(b),计算肿瘤体积。结果:1成功构建miR-221过表达的SHG-44胶质瘤细胞系,qRT-PCR检测稳定细胞系内miR-221的相对表达量为47±1.45,明显高于Vector转染细胞系(P<0.01)。2 miR-221过表达脑胶质瘤模型证实肿瘤生长速度明显增快。带瘤生存20天后取下肿瘤组织,发现miR-221过表达组肿瘤重量为对照组肿瘤重量的2倍余(P<0.05)。结论:miR-221过表达促进胶质瘤细胞体内生长,miR-221是一种促癌因子。