**荧光技术的实验方法及其分类

一、**标记法及其分类 

1.荧光**法
**焚光技术的实验方法及其分类原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb
浓度呈正比，可在8min内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。
以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除
去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体一抗原一抗体复合物。*后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。
传统的荧光**法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光**测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的
干扰。

2**荧光技术的实验方法及其分类 放射#法
放射**法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原一抗体复合物与无放射性的抗原一抗体复合物，并有过剩的标记抗
原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原一抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。
RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng /ml水平。但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏
度又有了较大提高，且操作大为简化，并己有商品试剂盒供应，使用方便。

3**荧光技术的实验方法及其分类.》酶联**法（ELISA）
ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的*低检测限为10μg / L，线性范围 
达l000ug /L。夹心ELISA法与EIA具有良好的相关性(r二0.92)。ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等
优点，易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。

以双抗法为例。首先包被抗原，然后加入一抗，使一抗与包被抗原形成抗原一抗体复合物。接着加入酶标二抗，形成抗原一抗体一抗体复合物。*后加入底物，由酶催化
底物生成产物。通过产物的生成量即可对蛋白抗原进行定量。

4.偶联生物素一亲和素系统的酶免法

利用了一个亲和素分子可以与4个生物素分子结合的特性，使传统的灵敏度较高的酶免法的灵敏度又有明显的放大作用。
5.时间分辨荧光#分析

时间分辨荧光**分析（Time resolved Fluor immunoassay, TRFIA)是一种非同位素**分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时
间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。

6**荧光技术的实验方法及其分类解离增强镧系元素荧光**分析
解离增强镧系元素荧光**分析（Dissociation Enhanced Lanthanide Fluor immunoassay DELFIA)是时间分辨荧光**分析中的一种。它用具有双功能基团结构的螯合剂， 
使其一端与铕（Eu)连接，另一端与抗体/抗原分子上的自由氨基连接，形成EU标记的抗体/抗原，经过**反应之后生成**复合物。由于这种复合物在水中的荧光强度非
常弱，因此加入一种增强剂，使Eu3从复合物上解离下来，自由Eu3同增强剂中的另一种螯合剂螯合形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧
光，信号增强了百万倍。因为这种分析方法使用了解离增强步骤，因此称为解离增强镧系元素荧光**分析。

二、荧光抗体染色方法及其分类

1.**荧光技术的实验方法及其分类直接染色法

将标记的特异荧光抗体直接加在抗原标本上，经一定温度和时间的染色，洗去未参加反应的多余荧光抗体，在荧光显微镜下便可见到被检抗原与荧光抗体形成的特异性结
合物而发出的荧光，直接染色法的优点是：特异性高，操作简单，比较快速，缺点是:一种标记抗体只能检查一种抗原，敏感性较差，直接法应设阴、阳性标本对照，抑
制试验对照。

2、间接染色法

如果检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（**抗体）与抗原标本进行反应，作用一定时间后，洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体即抗球蛋白抗体（第二抗体）
与抗原标本反应，如果**步中的抗原抗体互相发生了反应，则抗体被固定或与荧光素标记的抗抗体结合，形成抗原-抗体-抗抗体复合物，

3.抗补体染色法

抗补体染色法简称补体法，是间接染色法的一种改良法，首先由GOLDwasser等建立，本法利用补体结合反应的原理，用荧光素标记抗补体抗体，鉴定未知抗原或未知抗体
（待检血清）。染色程序也分二步：先将未标记的抗体和补体加在抗原标本上，使其发生反应，水洗，然后再加标记的抗补体抗体。如果**步中抗原抗体发生反应，形成
复合物，则补体便被抗原抗体复合物结合，第二步加入的荧光素标记的抗补体抗体便于补体发生特异性反应，使之形成抗原-抗体-补体-抗补体抗体复合物，发出荧光。

抗补体染色法具有和间接法相同的优点，此外，还有其独特的优点：即只需要一种标记抗补体抗体，便能检测各种抗原-抗体系统。因为补 体的作用没有特异性，它可以
与任何哺乳动物的抗原-抗体系统发生反应。它的缺点是参与反应的成分多，染色程序较复杂，比较麻烦。

除上述三种方法外，还有在此基础上演变出的一些方法，如双层法、夹心法、混合法，三层法、抗体-抗补体法等等