Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat) MaxUp核糖体RNA去除试剂盒(人/小鼠/大鼠)

产品信息

产品描述

Hieff NGS^® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)利用RNase H消化法去除人、小鼠、大鼠总RNA中的核糖体RNA以保留信使RNA（mRNA）和其它非编码RNA。该试剂盒对于完整和部分降解的总RNA（如FFPE RNA）均具有良好的rRNA去除效果。经rRNA去除所获得的RNA样本可用于高通量测序分析mRNA和非编码RNA，可显著提高测序结果中有效数据比例，也可用于cDNA合成或其它下游应用。

适用范围

适用于人、小鼠、大鼠来源的100 ng~1 μg 总RNA样品；适用于完整或部分降解RNA（如FFPE RNA）样品。

产品组分

运输与保存方法

干冰运输，-20°C存放。

注意事项

1. 请使用无RNase污染的耗材，并对实验区域定期进行清理，推荐使用Thermo Fisher公司的RNAZap^TM 高效核酸去除喷雾去除RNA酶污染。

2. RNA样品应不含基因组DNA污染，若样品中有gDNA残留，应先进行DNase I消化并纯化后再用于本试剂盒。

3. RNA样品最大投入体积为11 μL，若样品体积较大，可先进行浓缩。

自备材料

1. RNA纯化磁珠：Hieff NGS^® Cleaner（Cat#12602）或其他等效产品。

2. qRT-PCR质检rRNA去除效率：Hieff^® qPCR SYBR Green Master Mix(No Rox) （Cat#11201）或其他等效产品；

3. 其他材料： 无水乙醇、无菌超纯水、低吸附枪头、PCR管、磁力架、PCR仪等。

操作步骤

1. 探针杂交

1.1 将探针和杂交Buffer从-20 °C 取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。

1.2 准备RNA样品：根据投入量和样品浓度，计算RNA取样体积，用Nuclease free H₂O稀释至11 μL。

1.3 按照表1于200 μL PCR管中配制rRNA去除反应体系。

表 1 探针杂交反应体系

1.4 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

1.5 将上述 PCR 管置于PCR仪中，按照表2所示反应程序，进行探针杂交反应。

表 2 探针杂交反应程序

2. RNase H消化

2.1将RNase H消化试剂从-20 °C取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。按照表 3 所示，配制RNase H消化反应体系。

表3 RNase H消化反应体系

2.2 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

2.3 将上述 PCR 管置于PCR仪中，设置反应程序：37℃，30 min； 4℃，hold，进行RNase H消化反应。

3. DNase I 消化

3.1将DNase I消化试剂从-20 °C 取出，解冻后颠倒混匀，置于冰上备用。按照表4所示，配制DNase I消化反应体系。

表4 DNase I消化反应体系

3.2 使用移液器轻轻吹打混匀，瞬离将反应液离心至管底。

3.3 将上述 PCR 管置于PCR仪中，设置反应程序：37℃，30min； 4℃，hold，进行DNase I消化反应。

4. RNA纯化

4.1 准备工作：将 Hieff NGS^® RNA Cleaner （Cat#12602）磁珠由冰箱中取出，室温平衡至少 30 min。用Nuclease free H₂O配制 80%乙醇。

4.2 涡旋振荡或充分颠倒磁珠以保证充分混匀。

4.3 吸取 110 μL Hieff NGS^® RNA Cleaner（2.2×，Beads:DNA=2.2:1）至上一步产物中，移液器充分吹打混匀，室温孵育 5 min。

4.4 将PCR管置于磁力架中分离磁珠和液体，待溶液澄清后（约3 min），小心移除上清。

4.5 保持PCR管始终置于磁力架中，加入 200 μL Nuclease free H₂O新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠，室温孵育 30 sec 后，小心移除上清。

4.6 重复步骤 4.5，总计漂洗两次。用 10 μL移液器吸干净残留液体。

4.7 保持 PCR 管始终置于磁力架中，室温下开盖干燥磁珠（5~10 min）。

4.8 RNA洗脱：将PCR 管从磁力架上取下，加入 11 μL Nuclease free H₂O（或使用适合下游实验的相应体积Nuclease free H₂O或洗脱缓冲液），使用移液器轻轻吹打至充分混匀，室温静置 5 min。

4.9将 PCR管短暂离心并置于磁力架中静置，待溶液澄清后（约3 min），小心移取 10 μL 上清（可根据步骤4.7选择的实际洗脱体积进行相应调整）至新的Nuclease free PCR 管中。

【注】洗脱后的样品请立即进行下游实验，或置于-80℃存放。

案例展示

qPCR验证: 以1μg 293T RNA进行rRNA去除，利用qPCR对比去除前后rRNA基因和mRNA基因的表达量变化。