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HisSep Ni-NTA Agarose Resin （His标签蛋白琼脂糖纯化树脂）

Product Introduction

HisSep Ni-NTA Agarose Resin （His标签蛋白琼脂糖纯化树脂）

产品信息

产品名称	产品编号	规格	价格（元）
HisSep Ni-NTA Agarose Resin （His标签蛋白琼脂糖纯化树脂）	YB072D	10 mL	678.00
HisSep Ni-NTA Agarose Resin （His标签蛋白琼脂糖纯化树脂）	YB072D	50 mL	2848.00
HisSep Ni-NTA Agarose Resin （His标签蛋白琼脂糖纯化树脂）	YB072D	100 mL	5328.00
HisSep Ni-NTA Agarose Resin （His标签蛋白琼脂糖纯化树脂）	YB072D	1000mL	42686.00

产品描述

HisSep Ni-NTA Agarose Resin以高度交联的4%琼脂糖凝胶为基质，通过化学方法偶联四配位的氮川三乙酸（NTA）为配体，螯合镍离子（Ni²⁺）后，形成非常稳定的八面体结构，镍离子处于八面体的中心，这样的结构可保护镍离子免受小分子的进攻，与Ni-IDA树脂相比，更加稳定，可以耐受一定浓度的还原剂、变性剂或耦合剂等苛刻条件。已经成为实验室纯化His标签蛋白不可或缺的树脂之一。

产品性质

基质（Matrix）	高度交联的4%琼脂糖凝胶
粒径（Bead size）	45-165 µm
载量（Capacity）	＞40 mg 6×His-tagged protein/mL基质
耐压（Tolerance Pressure_max）	0.1 MPa，1 bar
储存缓冲液（Buffer）	含20%乙醇的1×PBS

运输和保存方法

冰袋运输。4℃保存。有效期2年。

注意事项

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

一、纯化流程

1 缓冲液的准备

缓冲液使用原理：低咪唑上样，高咪唑洗脱，或者高pH上样，低pH洗脱。Buffer 在使用前最好用0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤除菌。可溶性组氨酸标签蛋白纯化所需配方详见附表1。包涵体组氨酸标签蛋白纯化所需缓冲液及配方详见附表2。

2 样品准备

2.1 细菌表达的蛋白（本说明以细菌表达的蛋白纯化为例）

1）挑取单菌落到含有适合抗性的LB培养基中，根据载体说明加入相应的诱导剂诱导相应的时间。
2）表达结束后，将培养液转至离心瓶，7000 rpm，离心15 min，收集菌体，然后加入1/10体积的裂解液（Lysis buffer）和PMSF（PMSF在破碎前加入，其终浓度为1 mM），同时也可加入其他蛋白酶抑制剂，但不能影响目的蛋白与树脂的结合。
3）之后加入溶菌酶，使其工作浓度为1 mg/mL。【注】如果表达的宿主细胞内含pLysS或pLysE，可以不加入溶菌酶。
4）将菌体沉淀悬浮起来（如果菌液浓度高，可考虑加入10 µg/mL RNase A和5 µg/mL DNase I），混匀，置于冰上超声破碎细胞，至菌液基本保持澄清。

5）收集上述澄清蛋白液，10000 rpm，4℃离心20-30 min。取上清0.22 µm或0.45 µm滤膜过滤后置于冰上备用或-20℃保存。

2.2 酵母、昆虫和哺乳细胞分泌表达的可溶性蛋白

将细胞培养液转移至离心瓶，5000 rpm离心10 min，收集上清。如上清中不含EDTA、组氨酸和还原剂等，即可直接上柱纯化；如含有EDTA、组氨酸和还原剂等物质，则需用1×PBS 4℃下透析后方可上柱。

【注】对于大量体积的上清，需加入硫酸铵进行沉淀浓缩，之后经1×PBS 4℃下透析后上柱。

2.3 包涵体蛋白纯化（以细菌为例）

1）将培养液转移至离心瓶，7000 rpm，离心15 min，收集菌体去上清。

2）按照菌体：裂解液=1:10（w/v）的比例将菌体充分悬浮，混匀，冰浴超声破碎。

3）将破碎液转移至离心管，10000 rpm，4℃离心20-30 min，去上清。可重复步骤2）和3）一次。

4）按照菌体：裂解液（含8 M尿素）=1:10（w/v）的比例将包涵体充分悬浮。

5）变性条件下纯化His标签蛋白纯化。

3.样品纯化

1）装柱：将HisSep Ni-NTA Agarose Resin借助重力的作用装入合适的纯化柱中。
2）清洗：3-5倍柱体积去离子水冲洗色谱柱。
3）平衡：至少5倍柱体积的Lysis Buffer 平衡色谱柱。
4）上样：注意控制加样速度，确保目的蛋白与Ni²⁺充分接触，以提高纯化得率。
【注】注意收集流出液，用于后续SDS-PAGE检测蛋白的结合情况。

5）平衡/洗杂：Wash Buffer 平衡柱子，直到紫外吸收达到一个稳定的基线（一般至少10-15个柱体积）。注意收集流出液。
【注】在样品和结合缓冲液中加入低浓度咪唑可以提高样品纯度。

6）洗脱：使用5-10倍柱体积Elution Buffer洗脱，收集洗脱液即目的蛋白溶液。
7）清洗：依次用3倍柱体积的Lysis Buffer和5倍柱体积的去离子水清洗树脂。
【注】建议在清洗之前用更高浓度咪唑（如500 mM）彻底清洗纯化柱上结合的杂蛋白。
8）保存：5倍柱体积的20%乙醇平衡树脂，最后将树脂保存在20%乙醇的1×PBS中，置于4℃保存。

4 SDS-PAGE检测

将纯化过程中得到的样品（包括原始样品、流出组分、洗杂及洗脱组分等）利用SDS-PAGE进行检测，判定其纯化效果。

二、在位清洗

当填料使用过程中发现反压过高（＞0.5 Mpa）或者填料上面出现明显的污染时，需对其进行在位清洗（Cleaning-in-Place，CIP）。在位清洗时，先把Ni²⁺脱掉，清洗结束后，将填料保存在20%乙醇中，后者重新挂Ni后再保存在20%乙醇中。建议按照下面操作去除填料上残留的污染物，如沉淀蛋白、疏水蛋白和脂蛋白等。

1 .去除强疏水结合的蛋白，脂蛋白和脂类

使用30%异丙醇清洗5-10个柱体积，接触时间为15-20 min可以去除此类污染物。之后再用去离子水清洗10倍柱体积。也可以选择使用含有去污剂的酸性或者碱性溶液清洗填料2倍柱体积。例如含有0.1-0.5%非离子去污剂的0.1 M醋酸溶液，接触时间为1-2 h。去污剂处理后，需用70%的乙醇清洗5倍柱体积，彻底去除去污剂。最后利用去离子水清洗10倍柱体积。

2 .去除离子作用结合的蛋白

使用1.5 M NaCl 溶液接触10-15 min，之后用去离子水清洗10倍柱体积。

（三）填料再生

当填料使用过程中发现反压过高，填料上面出现明显的污染，或填料载量明显变低时，需要对其进行镍离子剥离及重新挂镍处理，即填料再生。按照下面操作流程进行：

1）使用5倍柱体积去离子水清洗填料；

2）使用5倍柱体积100mM EDTA（pH 8.0）剥落镍离子；

3）使用10倍柱体积去离子水清洗填料；

4）使用0.5M NaOH清洗5倍柱体积，停留10-15min；

5）使用10倍柱体积去离子水清洗填料；

6）使用3-5倍柱体积100mM NiSO4再生挂镍；

7）去离子水清洗10倍柱体积。

填料再生后，可立即使用，也可保存在20%乙醇中，置于4℃备用。

附表1 可溶性His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

缓冲液名称	配方	配制1 L溶液所需各种试剂量
Lysis Buffer pH8.0	50 mM NaH₂PO₄ 300 mM NaCl 10 mM imidazole NaOH调pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌	NaH₂PO₄·2H₂O 7.8 g NaCl 17.54 g Imidazole 0.68 g
Wash Buffer pH8.0	50 mM NaH₂PO₄ 300 mM NaCl 20 mM imidazole NaOH调pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌	NaH₂PO₄·2H₂O 7.8 g NaCl 17.54 g Imidazole 1.36 g
Elution Buffer pH8.0	50 mM NaH₂PO₄ 300 mM NaCl 250 mM imidazole NaOH调pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌	NaH₂PO₄·2H₂O 7.8 g NaCl 17.54 g Imidazole 17.0 g

附表2 包涵体His标签蛋白纯化所需缓冲液及配方

缓冲液名称	配方	配制1L溶液所需各种试剂量
Lysis Buffer pH8.0	8 M Urea 100 mM NaH₂PO₄ 100 mM Tris·HCl 盐酸溶液调pH至8.0，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌	Urea 480.5 g NaH₂PO₄·2H₂O 15.6 g Tris 15.76 g
Wash Buffer pH6.3	8 M Urea 100 mM NaH₂PO₄ 100 mM Tris·HCl 盐酸溶液调pH至6.3，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌	Urea 480.5 g NaH₂PO₄·2H₂O 15.6 g Tris 15.76 g
Elution Buffer pH4.5	8 M Urea 100 mM NaH₂PO₄ 100 mM Tris·HCl 盐酸溶液调pH至4.5，0.22 µm或0.45 µm过滤除菌	Urea 480.5 g NaH₂PO₄·2H₂O 15.6 g Tris 15.76 g

附表3 HisSep Ni-NTA Agarose Resin试剂耐受情况

试剂种类	浓度
还原剂	5 mM DTE 0.5-1 mM DTT 20 mM β-mercaptoethanol 5 mM TCEP 10 mM reduced glutathione
变性剂	8 M urea 6 M Gua-HCl
去污剂	2% Triton^TM X-100，nonionic 2% Tween^TM20，nonionic 2% NP-40，nonionic 2% Cholate，anionic 1% CHAPS，zwitterionic
其他类	500 mM imidazole 20% ethanol 50% glycerol 100 mM Na₂SO₄ 1.5 M NaCl 1 mM EDTA 60 mM citrate
缓冲液	50 mM sodium phosphate，pH 7.4 100 mM Tris-HCl，pH 7.4 100 mM Tris-acetate，pH 7.4 100 mM HEPES，pH 7.4 100 mM MOPS，pH 7.4 100 mM sodium acetate，pH 7.4

附表4 问题及解决方案

问题	可能原因	推荐解决方案
柱子反压过高	填料被堵塞	裂解液中可能含微小的固体颗粒，建议上柱前使用滤膜（0.22 µm或0.45 µm）过滤，或离心去除。
	填料被堵塞	样品中含高浓度的核酸，延长破碎时间直至粘度降低，或添加DNaseI （终浓度为5 µg/mL），Mg²⁺(终浓度1 mM)，冰上孵育10-15 min
	样品太黏稠	有机试剂或蛋白稳定试剂（如甘油等）可能会引起反压增高，降低操作流速。
洗脱组分中无目的蛋白	蛋白可能是包涵体	可通过电泳检测裂解液，分析上清中是否有目的蛋白，包涵体蛋白需按照包涵体蛋白的纯化方式
	表达量太低	优化表达条件，使用包涵体纯化缓冲体系
	目的蛋白结合比较弱，在洗杂步骤中已被洗下来	提高Wash Buffer的pH值，或者降低咪唑浓度
	目的蛋白结合过强，不容易洗脱下来	降低Elution Buffer的pH，或者增加Elution Buffer中的咪唑浓度
	目的蛋白结合过强，不容易洗脱下来	使用10-100 mM EDTA溶液剥离镍离子，同时得到蛋白
	蛋白降解	菌体破碎时需添加一些蛋白酶抑制剂
	蛋白降解	在4℃下进行纯化操作
洗脱组分不纯（含多种蛋白）	洗杂不彻底	增加Wash Buffer 体积
洗脱组分不纯（含多种蛋白）	样品中含有其他His标签蛋白	通过调节pH值或咪唑浓度来优化洗杂条件。再使用其他纯化手段（如去离子交换，疏水等）进一步纯化洗脱组分。
填料颜色变浅或变成白色	镍离子脱落或者剥离	按照填料再生的操作重新挂镍离子
填料呈现褐色	缓冲液中含有DTT等还原剂	参考附3适当降低还原剂DTT的浓度，或改用巯基乙醇
上样过程中蛋白发生沉淀	操作温度太低	室温下进行上样
	蛋白发生聚集	在样品和所有缓冲液中添加稳定剂，如0.1%Triton X-100或Tween-20