超级杂交液（原位杂交用）

产品及特点 

原位杂交是在一定生物结构基础之上的核酸杂交。这种结构基础可以是一条染色体；一个细菌；更大结构基础是细胞和组织。基本原理是两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或NA-RNA 双键分子，应用带有标记的（有放射性同位素，如3H、35S、32P、荧光素生物素、地高辛等非放射性物质）DNA或RNA片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸（RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的 mRNA或DNA 的存在并定位；用原位杂交技术，可在原位研究细胞合成某种多肽或蛋白质的基因表达。此方法有很高的敏感性和特异性，可进一步从分子水平来探讨细胞的功能表达及其调节机制。已成为当今细胞生物学、分子生物学研究的重要手段。本产品为公司开发的即用型原位杂交专用核酸杂交液。既可以用于RNA原位杂交、DNA原位杂交，也可以用于FISH原位杂交等试验。

运输及保存 低温运输和-20℃保存、有效期一年。

自备试剂 盖玻片、多聚甲醛等

使用方法 以检测 mRNA 序列为例。培养细胞和冰冻切片

1. 玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或 APES。切片厚度 10-20μm。

2. 细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养，条件为 37℃和 5%的 CO2，所用培养基为 Dulbecco 基础培养基。细胞长好后 0.1M PBS(PH7.4)洗 2分钟×3 次。

3. 培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定：固定液为 4%多聚甲醛/0.1 MPBS （PH7.2-7.6），含有 1/1000 DEPC。室温固定 20--30 分钟。蒸馏水充分洗涤，干燥后-20℃冰冻可保存 2 周以上。

4. 30%H2O2 1 份+纯甲醇 50 份混合，室温处理 30 分钟。蒸馏水洗涤 3 次。

5. 暴露 mRNA 核酸片段：切片上滴加 3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml3% 柠檬酸加 2 滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化 5—120 秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS 洗 3 次×5 分钟。蒸馏水洗 1 次。

6. 后固定：胃蛋白酶消化后才需要。固定液为 1%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.2-7.6），含有 1/1000 DEPC。室温固定 10 分钟。蒸馏水洗涤 3次。

7. 预杂交：湿盒的准备——干的杂交盒底部加 20%甘油 20ml 以保持湿度。按每张切片加 20μL 预杂交液（提前加入鲑鱼精 DNA，终浓度为100ug/ml）。恒温箱 38-42℃2—4 小时。吸取多余液体，不洗。

注：靶 DNA 的变性

DNA-DNA 杂交检测中，在杂交前需要增加靶 DNA 的变性步骤（对 mRNA的原位杂交无需此步）。样品 DNA 的变性可能会造成样品形态学的部分破坏，此步是实验中需要优化的一个步骤。实验时可以摸索变性时间、变性温度等参数以获得条件。可以将探针的变性和样品 DNA 变性同步进行：将样品和探针溶液加盖盖玻片，置于烘箱 80℃变性 ，处 理 5-10 min，后冷却至 37℃进行杂交。

8. 杂交——按每张切片 20μL 杂交液（探针浓度约为 1ng/ul；杂交液提前加入鲑鱼精 DNA，终浓度为 100ug/ml），加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后，盖在切片上。恒温箱 38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。

9. 杂交后洗涤：揭掉盖玻片，37℃左右水温的 2×SSC 洗涤 5 分钟×2 次；37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色，重复 0.2×SSC 洗涤 15 分钟×1-2 次)。

10. 滴加封闭液：37℃30 分钟。甩去多余液体，不洗。

11. 根据探针标记物，选择相应显色方法显色、复染，脱水、封片。

12. 结果观察。

石蜡切片

如果有条件的话，应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后，及时予以固定。固定液为 4%多聚甲醛/0.1 M PBS（PH7.0-7.6），含有 1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过 4mm 的小块，固定 1 小时即可，较大的标本固定不要超过 2 小时。某些组织对过度固定尤其敏感，如动物大脑，固定时间30-40 分钟，一般不要超过 1 小时。

1．常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度 6-8μm。

2．玻片的处理：一般采用多聚赖氨酸或 APES。

3．石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1 份+蒸馏水 10 份混合,室温 5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗 3 次。

4．暴露 mRNA 核酸片段：切片上滴加 3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶（1ml3% 柠檬酸加 2 滴浓缩型胃蛋白酶，混匀），37℃或室温消化 3--30 分钟（视标本新旧、厚薄自行调整）。用户可以比较不同的消化时间，例如 5 分钟,10 分钟，20 分钟，30 分钟。以找到消化时间。原位杂交用 PBS 洗 3 次×5分钟。蒸馏水洗 1 次。

5. 其余步骤和冰冻切片 6-11 步相同。

6. 结果观察。