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即用型蓝白T载体A型(T7-SP6,有MCS)
名称 | 编号 | 规格 | 价格 | 手册 |
---|---|---|---|---|
即用型蓝白T载体A型(T7-SP6,有MCS) | YB-363D | 20次 | 290元 |
英文名称:
运输:低温
保存:负20度
有效期:1年
货期:1-2天
其他:
产品介绍:
本产品是用Xcm I酶切环状的可保种型蓝白T载体(BTN60803)去掉一段1.3Kb的插入片段后得到的线性DNA片段(载体部分),其两个末端的5′都有一个突出的T,可以用于快速克隆具有加尾活性的耐热酶(如Taq DNA聚合酶)扩增得到的PCR片段。
产品特点:
1. 由于是通过Xcm I酶切制备,所以载体两端的带T率为100%,远高于用Taq DNA聚合酶和TdT末端转移酶在平末端载体加尾得到的T载体。
2. 克隆的阳性率一般在90%以上,缩短了筛选过程。
3. 插入位点两侧有对称的常见酶切位点(如EcoR I),便于对克隆的PCR片段进行近一步的分析。
4. 克隆位点两侧分别有T7和T3 RNA聚合酶启动子,便于用克隆的PCR片段制备RNA探针。
5.可以使用pUC/M13 Forward和Reverse测序引物测定插入片段的序列。
6. T克隆位点位于β-半乳糖苷酶的α-肽编码区内,可以进行蓝白斑筛选。
7.含有丝状噬菌体f1 复制起始子,可以制备单链DNA。
存条件:低温运输,-20℃保存,有效期两年。
使用方法:
一. PCR产物的纯化和定量
1. 将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分离。最好不要使用TBE缓冲液,因为它会影响DNA的胶回收效率。
2.在长波(360nm)紫外灯下快速切胶,尽可能切掉多余的凝胶。为避免嘧啶二聚体的形成,可以使用的DNA防护剂UV Scavenger。
3. 用柱式DNArc纯化回收PCR片段。溶解PCR片段的超纯水体积越小越便于后续操作。
4. 将回收的片段与浓度已知的DNA Marker在含EB或绿如蓝染料的琼脂糖凝胶中电泳,通过比较DNA条带的荧光强度而估测PCR纯化产物的浓度。注意:一般不推荐使用测OD260的方法,因为回收的DNA很珍贵,该方法需要比较多的DNA。
5. 如果所得的DNA片段浓度较低,可以使用本公司核酸浓缩剂将其浓缩到需要的浓度。
6. 如果PCR片段为平末端,则需要用加A试剂盒处理,否则不能用于与T载体的连接反应。
二. 连接反应
1. 短暂离心装有T载体的离心管。
2.在两个离心管中加入下列成分:
注:PCR纯化产物与蓝白T载体的摩尔比最好为3-10,可以按下面的公式计算出连接反应中需要的PCR纯化产物的ng数:
假如插入片段和载体的连接比例设定为3,连接反应中加入蓝白T载体(长度为3Kb)的量为40ng,则需要长度为0.5Kb的PCR纯化产物的量是:
3. 用移液器吹打连接反应使之混匀后,16℃孵育12小时(或按T4 Ligase供货商提供的说明书进行连接)。
三. 细菌转化
1. 将100μL感受态细胞于冰上解冻。注意:最好使用转化效率在1×108cfu/μg DNA以上的感受态细胞进行转化,因为采用单碱基突出端进行连接不是很有效。
2. 取5μL连接产物加入到感受态细胞中,轻轻旋转几次以混匀内容物。在冰上放置30分钟。
3. 将管放入预加温到42℃的水浴中,热休克90秒。快速将管转移到冰浴中。
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