质谱兼容型蛋白银染试剂盒

产品及特点 银染是目前检测 PAGE 电泳分离后的蛋白质的最灵敏的方法，MS（质谱）是确定未知蛋白最常用和最快捷的方法，但将银染得到的蛋白直接用于 MS 分析有很多问题，其中最主要问题是常规银染所使用的试剂（包括强氧化剂和醛类）容易使蛋白质发生化学修饰，这样 MS 分析得到的氨基酸信息跟蛋白质实际的氨基酸信息并不相同。为了使银染得到的蛋白质可以用于 MS 分析，为此本公司开发 MS 兼容型银染试剂盒，其特点如下：

1. 跟 MS 兼容，原理是避免使用能化学修饰蛋白质的试剂，所得蛋白质没有发生化学修饰，故可直接用于后续的 MS（包括 MALDI-TOF-MS 和 ESI-MS）分析。

2. 银染的灵敏度比考马斯亮蓝染色高 100 倍左右，可达 0.2-0.6 ng 蛋白质/条带。

3. 可用于各种 PAGE 胶，包括变性 PAGE 胶（如 SDS-PAGE，尿素-PAGE），非变性 PAGE 胶，IEF 胶（等电电泳胶），2D 胶等。

4. 四种溶液都是现用现配，实验结果的可重复性好。

规格及成分 成 份 编 号 大扁盒包装

溶液 A 组分一干粉 5 g

溶液 A 组分一溶剂 100 mL

溶液 A 组分二干粉 14g×10

溶液 B 干粉 5 g（棕色瓶）

溶液 C 组分一干粉 5g×10

溶液 C 组分二 2 mL

溶液 D 干粉 3g×10

使用手册 100811sc 1 份

运输及保存 常温运输及保存，有效期一年。

自备试剂 去离子水（最好 MilliQ 级别，电导在 5M以上），甲醇和乙酸。

使用方法 准备工作

所有溶液均需现配现用。以下按一块 PAGE 胶需要 200 mL 溶液配制，用户可以根据自己 PAGE 胶的大小增减溶液的用量。一：用自备试剂配制 400 mL 固定液（按一次银染需要固定 2 次计算，每次固定需

200 mL 固定液）

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将 160 mL 甲醇、40 mL 乙酸和 200 mL 去离子水充分混合后即得 400 mL

固定液。

二：配制 200 mL 溶液 A

先配制溶液 A 组分一储备液：将溶液 A 组分一干粉加入到 100 mL 溶液 A 组

分一溶剂中，充分摇晃溶解即得溶液 A 组分一储备液。此溶液可以 4℃保存。

将 60 mL 甲醇、8 mL 溶液 A 组分一储备液、1 份溶液 A 组分二（干粉）和

132 mL 去离子水充分混合后即得 200 mL 溶液 A。

三：配制 200 mL 溶液 B

称 0.5g 溶液 B 干粉，溶于 200 mL 去离子水中，充分混合后即得 200 mL 溶液 B。

四：配制 200 mL 溶液 C

将 1 份溶液 C（干粉）溶解在 200 mL 去离子水中（干粉不容易溶解，需搅拌）即得溶液 C。注意：使用前还需要再加入 160 uL 溶液 C 组分二并充分混匀。

五：配制 200 mL 溶液 D将 1 份溶液 D（干粉）溶解在 200 mL 去离子水中即得溶液 D。银染

1. PAGE 电泳（包括非变性 PAGE，SDS-PAGE，尿素-PAGE，2D-PAGE，IEF-PAGE 等）结束后，将 PAGE 胶转移到装有 200 mL 固定液的瓷盘或玻璃盘中，摇晃 30 分钟以去除干扰银染的组分（如甘氨酸、SDS、尿素、DTT、甘油等），倒掉固定液。注：此步很重要，否则银染背景很高。

2. 重复上步一次。

3. 将 PAGE 胶转移到 200 mL 溶液 A 中，室温摇晃 30 分钟。

4. 用 200 mL 去离子水漂洗 3 次，每次 5 分钟（不要延长或缩短）。

5. 将 PAGE 胶转移到 200 mL 的溶液 B 中，室温摇晃 20 分钟。

6. 用 200 mL 去离子水漂洗 2 次，每次 1 分钟（不要延长或缩短）。

7. 将 PAGE 胶转移到 200 mL 的溶液 C 中，室温摇晃直到蛋白电泳条带显现（一般需要 10 分钟左右）。

8. 将 PAGE 胶转移到 200 mL 的溶液 D 中，室温摇晃终止反应。

9. 用 200 mL 去离子水漂洗 3 次，每次 5 分钟（不要延长或缩短）。

10. 切下条带或胶块进行后续的脱银，原位 trypsin 酶解，多肽沉淀和 MS 分析（略）。

技术资料 MS 前处理步骤（仅供参考）

1. 脱银：将切下的银染斑点或条带用脱银液（30 mM K3Fe（CN）3和 100 mMNa2S2O3的 1：1 的混合液）处理直到黑色消失。

2. 还原：将胶块或胶条置于 10 mM DTT（溶剂为 50 mM NH4HCO3），56℃处理一小时。

3. 烷化：将胶块或胶条置于 55 mM 碘乙酰胺（溶剂为 50 mM NH4HCO3），室温避光处理 45 分钟。

4. 原位 trypsin 酶解：将胶块或胶条置于 10 ng/uL 测序级别的 trypsin 溶液中（溶剂为 25 mM NH4HCO3），37℃处理过夜。

5. 多肽提取：用 5%三氟乙酸抽提酶解液，再用 2.5%三氟乙酸-50%ACN 混合液抽提酶解液，上清真空干燥，沉淀（多肽）最后溶于 0.5%三氟乙酸中。

6. MS 分析：参考相关 MS 仪器使用手册。