动植物膜蛋白微量制备试剂盒

产品及特点 细胞膜蛋白质参与了很多重要的细胞活动，根据它们与膜结合的位置一般分为两种，一种是附着在细胞膜上，另一类是嵌入到细胞膜中间。附着型膜蛋白疏水性较弱，比较容易提取和纯化；而嵌入型膜蛋白疏水型很强，所以在水溶液里面很难溶解，非常难以提取和纯化。天恩泽基因根据上述特点，经过精心优化的、开发出本产品，专门用于分离纯化这两种膜蛋白。它具有下列特点：

1. 两步法提取，先纯化含膜组分，再分离附着型膜蛋白和嵌合型膜蛋白。

2. 膜蛋白（附着型+嵌入型）产量高，对肝脏组织而言，其线粒体膜蛋白产率为 10 ug/mg 左右，过氧化物酶体为 1 ug/mg 左右，内质网为 25-30ug/mg。

3. 所得的膜蛋白大部分具有生物活性，可用于活性研究。

4. 可用动物、植物培养细胞和实体细胞为材料，也可用预先纯化的含膜组分或细胞器（如线粒体、叶绿体、内质网、过氧化物酶体）为材料（本试剂盒不含纯化细胞器的试剂）。

5. 本方法重复性好。

6. 本试剂盒足够 50 次微量提取，分 A 型和 B 型两种。A 型用于附着型膜蛋白，B 型用于嵌合型膜蛋白和附着型膜蛋白。

运输及保存 常温运输及保存，有效期一年。

自备试剂 PBS，电泳上样液。

使用方法 1、 对培养细胞：收集 1×107 个培养细胞（动物细胞、植物细胞），用 20 mL自备的冰浴的 PBS 洗涤三次，每次洗涤后需要 4℃下 1000 g 离心 2 分钟，然后小心弃上清。对实体组织：由于各种动植物的各种实体组织的属性差别太大，故本手册的纯化膜组分的操作步骤（第 1-7 步）不一定完全适合，用户需要自行优化以纯化含膜组分或含膜的细胞器（如细胞质膜、内质网、线粒体、叶绿体等），再将含膜组分或细胞器沉淀直接用于第 8 步的膜蛋白提取。

2、 将洗涤后的细胞沉淀重悬在 2 mL 溶液 A 中，冰上静置 10 分钟。注意：膜蛋白有膜的保护，在纯化过程中对蛋白酶的降解没有胞浆蛋白敏感，一般可以不加蛋白酶抑制剂。但如果纯化的膜蛋白的确有降解的话，可以在溶液 A 中加入自备的蛋白酶抑制剂混合物。

3、 转移到容积为 2 mL 的 Dounce 玻璃匀浆器上下匀浆 20-50 次（具体次数取决于细胞种类，293T 细胞一般需要 20 次左右，而 MEF 细胞一般需要50 次左右。用样品先进行预实验以摸索佳匀浆次数，佳匀浆次数时在显微镜下能看见细胞破裂但细胞核完整）。

4、 将匀浆液转移到 15 或 50 mL 塑料管中，加入相当于匀浆液体积 1/10 的溶液 B，其间可以轻柔颠倒混匀 3-5 次，留少量样品作为对照 1（匀浆液）。

5、 4℃ 2500 rpm 离心 20 分钟，沉淀为细胞核，上清为胞浆和膜成分，留少量样品作为对照 2（胞浆和膜成分）。

6、 将上清液用 Beckman Optima 台式超速离心机 100,000 g 4℃离心 60分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该为 100,000g，否则有可能得不到膜成分沉淀。

7、 小心转移上清（胞浆部分）并留少量样品作为对照 3（胞浆）。

8、 将沉淀（含膜组分）重悬于 1 mL 冰浴的溶液 C 中后，冰上静置 30 分钟，留少量样品作为对照 4（膜成分）。本成分电泳前，需要先用自备的 TCA沉淀（TCA 终浓度为 10%），再用冰冷的丙酮洗涤两次后再溶解在 1×上样液中待用。对照 1-3 号不需要这样的预处理。

9、 用 Beckman Optima 台式超速离心机 100,000g 4℃离心 60 分钟。也可以使用其他冷冻超速离心机，但离心力应该一致，否则有可能得不到沉淀。

10、如果需要附着型膜蛋白，则取上清（含附着型膜蛋白）弃沉淀（含膜和其中的嵌合型膜蛋白）。上清可以放-20℃长期保存，如果需要电泳，需要先用自备的 TCA 沉淀（TCA 终浓度为 10%），再用冰冷的丙酮洗涤两次后再溶解在 1×上样液中与对照 1-4 号一起上样电泳。

11、如果需要嵌合型膜蛋白，则取出上清（含附着型膜蛋白）并留少量样品作为附着型膜蛋白样品，然后再用 1 mL 冰浴的溶液 C 重悬沉淀，然后100,000g 4℃离心 60 分钟，去掉上清（上清含残留的附着型膜蛋白，可 以留样作为洗涤后的附着型膜蛋白样品）。沉淀含膜和其中的嵌合型膜蛋 白。如果需要测定膜蛋白的浓度，则将其溶解在自备的 0.5 M NaOH 溶液