细胞核蛋白提取试剂盒（溶胀法）

产品及特点DNA 只存在于细胞核内，因此参与转录调节和 DNA 复制的蛋白质主要存在于 细胞核中，要研究蛋白质与 DNA 的相互作用，首先需要制备能够与 DNA 作用的 天然细胞核蛋白质。目前、细胞核蛋白质制备方法一般都比较繁琐，一次处理大量 样品时尤其不便，为此本公司基于溶胀法原理开发了本产品，用于从哺乳动物组织 和培养细胞核蛋白的温和微量提取，它具有下列特点：

1. 提取制备过程简便，只需要一小时。

2. 实验重复性好，尤其适合同时处理多个样品。

3. 可用于培养的动物细胞，也可以用于新鲜组织细胞。

4. 提取步骤温和，制备的核蛋白能保持天然活性，可以直接用于转录因子活性分 析、凝胶阻滞实验(gel shift assay)、免疫共沉淀、Western Blotting、DNA 足迹图实验和甲基化干扰实验酶活性测定等研究。

5. 1×10E6 个细胞中可以得到 50-70 ug 的核蛋白质。

6. 只适用于哺乳动物组织和培养细胞，不适用于植物和真菌等生物。
规格及成分 成 份 编 号 小扁盒包装
动物细胞溶胀液 YB-441R 50 mL
动物细胞核溶胀液 YB-441R 10 mL
使用手册 YB-441R 1 份

运输及保存 低温运输和保存，有效期一年。

自备试剂 PMSF、DTT、PBS、胰酶溶液等

使用方法实验前准备：取适当量（根据样品数量确定）的动物细胞溶胀液和动物细胞核溶胀 液到新的塑料瓶中，置于冰上预冷，并在使用前数分钟内同时向动物细胞溶胀 液和动物细胞核溶胀液中加入自备的 PMSF 和 DTT，使 PMSF 的最终浓度为 0.2 mM，DTT 的最终浓度为 1 mM。实验中所用试剂均需先预冷。 一、提取培养细胞和悬浮细胞细胞核：

1. 培养细胞：将覆盖率为 55-65%的培养细胞用自备的胰酶溶液按标准的胰酶法 处理，然后刮到 1.5 mL 塑料离心管中，4℃ 600g 离心 3 分钟，小心弃上清。 细胞数量最好在 5×10E5-7 个。细胞沉淀体积约 0.1mL。

2. 悬浮细胞：直接将 5×10E5-7 个悬浮细胞转移到 1.5 mL 塑料离心管中，4℃ 600g 离心 3 分钟，小心弃上清。细胞沉淀体积约 0.1mL。

3. 用 1mL 自备的预冷的 PBS 缓冲液重悬细胞沉淀，然后 4℃ 600g 离心 3 分 钟，小心弃上清。注意：必须尽快用 PBS 缓冲液洗涤细胞沉淀，否则沉淀细 胞产生的 CO2 将使局部 pH 减低产生毒性。

4. 在细胞沉淀中加入 1mL 预加了 PMSF 和 DTT 的动物细胞溶胀液，用手指轻 柔弹管壁使细胞沉淀悬浮起来。最好不要用枪头。

5. 冰浴 10 分钟。如果有条件可以取少量样品涂片，在显微镜下观察，90%的细 胞将呈现气球状。如果没有则继续冰浴直到 90%的细胞呈现气球状。

6. 涡旋激烈震荡 10-30 秒混匀。如果有 Dounce 玻璃匀浆器，也可以用预冷的 匀浆器匀浆 10-12 次。如果有条件可以取少量样品涂片，在显微镜下观察， 90%的细胞将破裂。如果未破裂细胞折光度高，并且没有膨胀，则表示这些细 胞已经死亡。如果这样的细胞太多，则需要重新取样。

7. 4℃ 1000g 离心 3 分钟，小心弃上清。沉淀为细胞核，上清为胞浆成分，如 果需要可以留存上清。

8. 在细胞核沉淀中加入 100 μL 预加了 PMSF 和 DTT 的、预冷的动物细胞核溶 胀液，轻弹离心管混匀，使沉淀悬浮起来。

9. 冰浴 20 分钟。

10. 4℃ 1000g 离心 2 分钟，小心收集上清液（细胞核提取物），可立即用于后续 的凝胶滞后实验、BCA 法蛋白浓度测定、活性检测、SDS-PAGE 电泳、2D 电泳等实验，也可以分装后放-70℃长期保存。 说明：本方法可以从 1×10E6 个细胞中得到 50-70 ug 的核蛋白质。 二、对新鲜组织：

11. 将 100-150 mg 新鲜组织置于培养皿中，用手术剪将组织尽可能切成非常细 小的碎片，尽量去除脂肪组织和结缔组织等非目的组织，用自备的 PBS 缓冲 液洗涤 2 次，离心后去上清。在组织沉淀中加入 400 uL 预加了 PMSF 和 DTT 的动物细胞溶胀液，在预冷的玻璃匀浆器内充分匀浆。匀浆需在冰浴或 4oC 进行。

12. 匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内，用手指弹管壁使沉淀悬浮起来，冰浴放 置 10-20 分钟，涡旋激烈震荡 10 秒混匀。

13. 接下来按照步骤 7-10 操作，即得到新鲜组织细胞核蛋白提取物。