BCA法蛋白定量试剂盒

产品及特点

本产品是基于 BCA 法（bicinchoninic acid，二奎啉甲酸法）蛋白检测原理开发的蛋白质浓度测定产品，BCA 法跟 Lowry 法的一步完全相同，就是在碱性条件下，蓝色的 Cu2+被蛋白质还原成紫色的 Cu+。此反应类似 Cu2+与 Biuret（NH2-CO-NH-CO-NH2，双缩尿）发生的反应，故又叫 Biuret 反应（Biuret反应本省就可以测定蛋白质浓度，目前仍然是医院血液蛋白定量的方法）。第二步，Cu+与 BCA 发生反应形成水溶性的紫色化合物，通过分光在 562 nm处测定紫色化合物的量就可以精确定量蛋白质浓度。BCA 检测灵敏度比 Biuret 反应高 100 倍左右。

一步

Biuret 反应

第二步

BCA 反应

此方法的特点如下。

1. 对各种常见的去污剂不敏感，但对 Cu 的还原剂和螯合剂比较敏感。

2. 比 Lowry 法更加简单快捷，45 分钟内完成测定。

3. 试剂稳定，室温可以放置两年。工作液 1 天内有效。

4. 线性范围在 20～2000 μg/mL。如果需要范围在 0.1-10ug/mL，需要选

用超敏 BCA。

5. 最小测量体积为 1-20 uL。

6. 终产物稳定，变异系数远小于考马斯亮蓝法蛋白定量。

7. 可以检测最短到双肽，而 Bradford 法需要一定大小的蛋白质。

8. 有常规（试管）和微量（96 孔板）两种检测模式。

运输及保存 常温运输和保存，但 BSA 标准品需要低温运输，-20℃保存，有效期两年。

自备试剂 样品缓冲液

使用方法 一：96 板操作模式

1、 取一块 96 孔板，先进行编号（编号可以根据样品数增加），并按照下表加入

BSA 标准，待测样品和溶解待测样品的缓冲液(可以用水替代)：

编号

BSA 标准

（2ug/μL）

待测样品

（μL）

样品缓冲液

（μL）

总体积

（μL）

蛋白含量

（μg）

0 0 0 20 20 0

1 1 0 19 20 2.0

2 2 0 18 20 4.0

3 4 0 16 20 8.0

4 8 0 12 20 16.0

5 12 0 8 20 24.0

6 16 0 4 20 32.0

7 20 0 0 20 40.0

样品 1 0 X 补到 20 20 未知

样品 N 0 Y 补到 20 20 未知

2、 计算 BCA 工作液需要量：根据样品数量（包括制备标准曲线的样品的数量）和每个样品需要 0.2 mL BCA 工作液的比例，计算所需 BCA 工作液的用量，然后加上 10%损耗作为实际需要配制的量。例如：计算出需要 5mL 工作液，实际按不少于 5.5 mL 的量配制。

3、 配制 BCA 工作液：按 50 体积溶液 A 加 1 体积溶液 B（50:1）的比例将二者充分混合，所得溶液即 BCA 工作液。比如：5 ml 溶液 A + 100 μl 溶液

B。注意：取用溶液 A 和溶液 B 前需要充分摇匀，溶液 B 非常容易形成沉淀，需要 65℃加热溶解后才能使用。当把溶液 B 刚加入到溶液 A 中时，最初会出现淡绿色沉淀，轻微晃动沉淀即会消失，工作液后成绿色，可以室温放置 12 天，但需要将容器的盖子拧紧。

4、 将 10 倍体积（20μL 的 10 倍体积即 0.2 mL）的 BCA 工作液加入到各孔中并混匀。也可把 96 孔板放在振荡器上振荡 30 秒混匀。

5、 37℃放置 30 分钟。

6、 冷至室温，10 分钟内完成后续测定，否则化学反应还在继续进行，使光吸收值慢慢升高，每 10 分钟会升高 2.5%左右。

7、 在 562 nm 下比色测定样品的光吸收。如酶标仪没有 562 nm 的设定，可用接近的波长检测，如 570 nm。

8、 将编号为 0 号的样品（对照）的读数从其余所有样品（包括 0 号样品，其读数变成零）中扣除。

9、 以 0-7 号样品的 BSA 含量（μg，见上表最右行）为横坐标，以样品的吸光值为纵坐标，绘出 BSA 的标准曲线。

10、再将待测样品的吸光值（减去 0 号样品的读数后的值）标在标准曲线上，其在横坐标上对应的蛋白含量（μg）就是待测样品中的蛋白质含量，除以样品稀释液总体积（20 μL），乘以样品稀释倍数即为样品浓度（μg/μL）。

二：试管测定模式

1、 基本操作同上，只是操作改在编号的玻璃试管中进行，同时 BSA 标准品（2ug/uL）的使用量从低到高改为 0、5、10、20、40、60、80、100uL，样品的总体积从 20uL 改为 100uL，BCA 工作液的用量从每个样品 0.2 mL改为 2 mL。

三：注意事项

1、 BCA 法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。所以，如果蛋白质浓度较低，可以改在 60℃孵育 30分钟或更长。

2、 待测样品浓度在 20～2000 微克/毫升浓度范围内有较好的线性关系。

3、 在一定浓度范围内 BCA 法测定蛋白浓度不受下列化学物质的影响：

名称 在此浓度下不受影响

Ammonium Sulfate 1.5 M

Brij-35 5.0%

CHAPS 5.0%

EDTA 10 mM

Hepes 100 mM

Glycine, pH 2.8 100 mM

Guanidine HCl 4.0 M

Tween 20、60、80 5.0%

SDS 5.0%

Sodium Acetate pH 5.5 200 mM

Sodium Chloride (NaCl) 1.0 M

Sucrose 40%

Sodium Hydroxide (NaOH) 0.1 M

NP-40 5.0%

Triton X-100 5.0%

Urea 3.0 M

4、 本方法受样品中螯合剂和还原剂的影响，所以需确保 EDTA 浓度不高于10mM，二硫苏糖醇不高于 1mM，β-巯基乙醇不高于 1mM，没有任何EGTA，否则建议使用 Bradford 蛋白浓度测定试剂盒（CAT#:80815）。