包涵体大量纯化试剂盒

产品及特点 本产品是天泽基因包涵体微量纯化试剂盒（CAT#：90508）的大提升级产品，用于大量，快速的提取高质量的包涵体。它具有下列特点：

1. 大量提取，1 次可处理多达 5 升的菌液，相当于 50 次中量提取。

2. 适合制备级别的包涵体纯化，需在 50 mL 以上的离心管或离心瓶中完成。

3. 能有效去除包涵体中的细胞壁和细胞膜等非重组蛋白成份，使重组蛋白在包涵体中所占比重达到 60%以上。

4. 即可以选择高压裂解法，也可以采用酶学裂解法裂解细菌。

5. 得到的包涵体可以用于重折叠，也可以用于凝胶层析和动物免疫。 规格及成分 成 份 编 号 2 次包装

包涵体大量纯化溶液 A 90510A 100 mL

包涵体大量纯化溶液 B 90510B 250 mL×2

包涵体溶解液 90510C 100 mL

溶菌酶 100406 100 mg

使用手册 90510sc 1 份

运输及保存 常温运输，4℃保存（溶菌酶需要-20℃保存，包涵体溶解液可以室温保存），有效期一年。 自备试剂 如果得到的重组蛋白确有降解则需要自备蛋白酶抑制剂混合物（CAT#：80808）

使用方法 一． 细胞沉淀：

1. 转移 1-5 升菌液到干净的、预称重量的塑料离心瓶中。如果离心瓶体积不够大，可以分多次反复离心收集。

2. 5,000 g （相当于 Sorvall GSA 转头 5500 rpm） 4℃离心 15-30 分钟，小心弃上清。

3. 复称重量，差值就是细菌的湿重。1 升的过夜培养的大肠杆菌湿重一般为 3 克，所以 1-5 升菌液一般能得到 3-15 克细菌。注意：后续操作的很多溶液都是按此步得到得细胞湿重添加。

4. 细胞沉淀可以立即使用或存放在-80℃待用。 二． 细胞裂解(下面两法中选其一)：高压破碎法（French Press）+超声法（推荐方法）

1. 按每克细菌湿重加入 3 mL 溶液 A 重悬细胞，可以用玻璃棒搅拌或用 Waring捣碎机匀浆（如果细菌湿重超过 10 克）使细菌悬浮，直到检测不到成块的细胞为止。如有必要，可以加入溶菌酶干粉，使其终浓度为 0.2mg/mL。

2. 让细胞通过压力为 16000-18000 lb/in2的高压细胞破碎仪，收集的细胞裂解液需放冰上。

3. 重复上步操作一次或多次，直到绝大部分细菌都被裂解。注意：每次处理后最好在显微镜下检查细菌裂解的比例。

4. 将细胞裂解液置于冰浴中，用超声破碎仪满功率下超声处理 5 分钟，工作状态为 50%（开 0.5 秒，关 0.5 秒）。此过程中最好将细胞裂解液放冰上并用磁力搅拌器搅拌，否则产生的热量会使包涵体蛋白变性，在纯化中丢失。 酶法+超声法（在没有高压破碎仪器时首选方法）

1. 按每克细菌湿重加入 3 mL 的含溶菌酶的溶液 A 重悬细胞，可以用玻璃棒搅拌细菌沉淀使之悬浮。

2. 在细菌悬浮液中加入溶菌酶干粉，使其终浓度为 0.2mg/mL，搅拌混匀后 37℃放置 30 分钟裂解细菌，其间不时需要用玻璃棒混匀。细菌释放出的 DNA 将使裂解物变得十分粘稠。如果不粘稠，说明裂解不充分，需要继续裂解，否则完整细菌将和包涵体一起沉淀，影响包涵体的纯度。由于处理量大，最好在显微镜下检查细菌是否充分裂解。

3. 将细胞裂解液置于冰浴中，用超声破碎仪满功率下超声处理 5 分钟，工作状态为 50%（开 0.5 秒，关 0.5 秒）。此过程中最好将细胞裂解液放冰上并用磁力搅拌器搅拌，否则产生的热量会使包涵体蛋白变性，在纯化中丢失。 三． 包涵体纯化：

1. 将超声处理的细胞裂解液转移到离心瓶中，22，000g 4℃下高速离心 60 分钟（注意：转子不同其对应的离心速度不同），小心收集上清。上清含有以可溶形式存在的重组蛋白，可以保留作为 SDS-PAGE 对照样品。

2. 将沉淀（主要由包涵体构成）悬浮在预冷的溶液 B 中。每克细菌需要 5 mL 溶液 B，1 升细菌的湿重约 3 克，大约需要 15 mL 溶液 B，用玻璃棒或匀浆器搅拌混匀后室温放置 5 分钟。

3. 22，000g 4℃下高速离心 30 分钟，沉淀将出现三层，最下面的是未彻底破裂的细胞碎片，其上是包涵体，最上层的松软沉淀是细胞壁和细胞外膜。如果处理过程中使用过溶菌酶，则此层较薄。小心收集上清，可以作为包涵体第一次洗涤的对照样品。

4. 重复第 8-第 9 步直到上清变清和最上层细胞壁和细胞外膜松软沉淀消失，此过程一般需要重复洗涤 2 次（共 3 次洗涤），小心收集上清作为包涵体第二次洗涤和第三次洗涤的对照样品。本试剂盒提供的溶液 B 足够一次 5 升规模的提取洗 3 次，如需更多溶液 B 请单独购买。

5. 上步得到的沉淀即为包涵体，其中重组蛋白一般占 60%重量，其余 40%为其他蛋白质。此沉淀可以长期放置在-80℃冰箱待用，也可以直接用于免疫动物制备抗体，还可以直接进入下面得包涵体的溶解步骤。

6. 估计重组蛋白的产率：首先需要通过预实验知道重组蛋白的表达水品，如果表达水平为 1%，则 1 克湿重的细菌中将含有 1 mg 重组蛋白质。此法得到的重组蛋白质的回收率一般在 75%，即 1mg 重组蛋白质能得到 0.75 mg，丢失0.25mg。 四．包涵体的溶解：

1. 在室温下，将包涵体溶解液加入到包涵体沉淀中，用枪头充分吹打后漩涡震荡。如果需要将溶解的包涵体直接用于凝胶过滤层析进一步纯化，则按每克原始细胞湿重加入 1 mL 包涵体溶解液，重组蛋白的浓度约为 4-5 mg/mL；如果需要将溶解的包涵体直接用于蛋白质折叠，则按每克原始细胞湿重加入 3 mL 包涵体溶解液, 重组蛋白的浓度约为 1-2 mg/mL；注意：包涵体溶解液低温放置会产生沉淀，必须 45-65℃溶化并混匀后才能使用。

2. 室温放置 1 小时使蛋白质充分溶解。

3. 100,000g 4℃离心 60 分钟(转速需要根据离心机转子的大小换算)，小心收集上清，保留不溶性沉淀。注意：检查离心管能否承受此离心力。SDS-PAGE检查是否大部分重组蛋白都在上清中。如果没有，说明包涵体没有完全溶解，需要用适当增加包涵体溶解液的用量。

4. 将上清（溶解的包涵体）分成 10-20mL 一份，放于塑料离心管中（不要超过离心管容量的 70%）置-80℃长期保存或直接用于复性等试验。由于不同的蛋白质有不同的最佳复性条件，需要用户自己摸索。包涵体纯化过程中引入了溶菌酶，在 SDS-PAGE 分析时可能有额外条带出现。