Hifair® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)

产品信息

产品描述

Hifair^® III 1st Strand cDNA Synthesis Kit (gDNA digester plus)是含有gDNA去除步骤的cDNA第一链合成试剂盒。该试剂盒基于Hifair^® III Reverse Transcriptase而开发。该酶cDNA合成速度快，且热稳定性大幅度提高，可耐受高达60℃的反应温度，适合具有复杂二级结构的RNA模板的逆转录。同时，该酶增强了与模板的亲和力，适合少量模板以及低拷贝基因的逆转录。Hifair^® III Reverse Transcriptase合成全长cDNA的能力也有了提升，可扩增长达19.8 kb的cDNA。

该试剂盒包含gDNA digester Mix，可去除RNA模板中残留的基因组DNA污染，保证后续结果更加可靠。该试剂盒提供三种cDNA合成引物：Random Primers N6、oligo (dT)₁₈和优化过的Primer Mix，用户可根据需要，选择Primer Mix，Random Primers N6，Oligo (dT)₁₈或Gene Specific Primers作为逆转录引物，合成的单链cDNA产物可直接用来进行后续PCR或者qPCR反应。

产品组分

【注】

1）5×Hifair^® III Super Mix 包含gDNA digester抑制剂、dNTP和RNase inhibitor。

2）Primer Mix包含优化配比的Oligo (dT)₁₈ 和 Random Primers N6。

运输与保存

干冰运输。-20℃保存，有效期18个月。

注意事项

1）反应液的配制应在冰上操作完成，操作过程应避免RNase污染。

2）建议RNA是溶于水而不是TE中，因为TE会干扰gDNA去除以及逆转录反应。

3）5×gDNA digester Mix、5×Hifair^® III Super Mix使用前请轻轻上下颠倒混匀，并小心离心至底部。吸取液体时请使用量程合适的移液器，枪头不要插入液面下过深。

4）qPCR 实验推荐基因组去除步骤，保证结果更加真实可靠。

关于逆转录引物的选择

1） 如果模板为真核生物来源，建议选择Oligo (dT)₁₈ ，与真核生物mRNA的3’ Poly A尾配对，可获得最高产量的全长cDNA。 

2）原核生物RNA的反转录请选用Random Primers N6或者基因特异性引物。

3）qPCR实验，请优先选择Primer Mix 。

第一链cDNA合成操作步骤

一、后续试验为qPCR

1.gDNA 消化

在RNase free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。

2. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

【注】：

1）逆转录引物：荧光定量实验推荐使用Primer Mix。

2）建议先加入5×Hifair^® III Super Mix混匀后再添加反转录引物，以保证完全抑制gDNA digester的活性。

3）逆转录前，请用移液器轻轻吹打混匀。

3. 逆转录程序设置

【注】：逆转录温度：推荐使用55℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到60℃。

4. 逆转录产物可以-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。

二、后续试验为PCR

1. RNA模板变性

在RNase free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。65℃孵育5 min，迅速置于冰上，并静置3min。

2.gDNA 消化

在RNase free离心管中配制如下混合液，用移液器轻轻吹打混匀。42℃孵育2 min。

【注】：若无需进行gDNA消化，推荐将逆转录引物加入到第1步RNA模板变性的体系中，最后补齐总体系为16μL，反应结束后加入4 μL 5×Hifair^® III Super Mix进行逆转录反应。

3. 逆转录反应体系配制（20 μL体系）

【注】：

1）建议先加入5×Hifair^® III Super Mix混匀后再添加反转录引物，以保证完全抑制gDNA digester的活性。

2）逆转前，请用移液器轻轻吹打混匀。

4.逆转录程序设置

【注】：

1）逆转录温度：推荐使用55℃。对于高GC含量模板或者复杂模板，可将逆转录温度提高到60℃。

2）可将逆转录时间延长到45-60min，有助于提高产量。

5.逆转录产物可以-20℃短期保存，若需长期保存，建议分装后，于-80℃保存，避免反复冻融。