Annexin V- Alexa Fluor 488/PI 细胞凋亡检测试剂盒

产品信息

产品描述

Annexin V-Alexa Fluor488/PI细胞凋亡检测试剂盒（Annexin V-Alexa Fluor488/PI Apoptosis Detection Kit）是用Alexa Fluor488标记了的Annexin V作为探针，来检测细胞早期凋亡的发生，可用流式细胞仪或其他荧光检测设备进行检测。

其检测原理为：在正常的活细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞膜的内侧，但在早期凋亡的细胞中，PS 从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中。Annexin-Ⅴ（膜联蛋白-V）是一种分子量为35-36KD的Ca²⁺ 依赖性磷脂结合蛋白，能与PS高亲和力结合。可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。

另外，本试剂盒中还提供了碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）用来区分存活的早期细胞和坏死或晚期凋亡细胞。PI是一种核酸染料，它不能透过正常细胞或早期凋亡细胞的完整的细胞膜，但可以透过凋亡晚期和坏死细胞的细胞膜而使细胞核染红。因此，将Annexin V与PI联合使用时，PI 则被排除在活细胞（Annexin V-/PI-）和早期凋亡细胞（Annexin V+/PI-）之外，而晚期凋亡细胞和坏死细胞同时被Alexa Fluor488 和PI 结合染色呈现双阳性（Annexin V+/PI+）。

产品组分

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。本试剂盒中所有组分均在4℃保存，Annexin V-Alexa Fluor488、PI需避光保存。

注意事项

1）由于细胞凋亡是一个快速的过程，建议样品在染色后1小时之内进行分析。

2）对于贴壁细胞，消化是一个关键步骤。贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞后合并染色。处理贴壁细胞时要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，PI摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上磷脂酰丝氨酸与Annexin V-Alexa Fluor488的结合。消化时将胰酶铺满孔板底后，轻摇时胰酶与细胞充分接触，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可终止。在消化液中尽量不用EDTA，EDTA会影响Annexin V与PS的结合。

3）如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS，能与Annexin V结合，从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在200 g离心洗去血小板。

4）试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体甩至管底，避免开盖时液体洒落。

5）Annexin V-Alexa Fluor488和PI是光敏物质，在操作时请注意避光。

使用说明

1.1 样品染色

1. 悬浮细胞：300 g，4℃离心5 min收集细胞。

贴壁细胞：用不含EDTA的胰酶消化后，300 g，4℃离心5 min收集细胞。胰酶消化时间不宜过长，以防引起假阳性。

2. 配制1×Binding Buffer：用去离子水按1:4 稀释4×Binding Buffer（4mL 结合缓冲液+12 mL 去离子水）。

3. 用4℃预冷的PBS洗涤细胞2次，每次均需300g，4℃离心5 min。

4. 加入250 μL 1×Binding Buffer重悬细胞，调节其浓度为1×10⁶/mL。

5. 取100 μL细胞悬液于5mL流式管中，加入5μL Annexin V-Alexa Fluor 488和10 μL PI，轻轻混匀。

6. 避光、室温反应15 min。

7. 加入400 μL 1×Binding Buffer，混匀，样品在1小时内用流式细胞仪检测。

注：为了避免洗涤细胞时损失细胞，在吸液时可以用大的Tip头套上小的Tip头吸液。

1.2 流式细胞仪分析

Alexa Fluor488最大激发波长为488 nm，最大发射波长为519 nm；PI-DNA复合物的最大激发波长为535 nm，最大发射波长为615 nm。用CellQuest等软件进行分析，绘制双色散点图（two-color dot plot），Alexa Fluor488为横坐标，PI为纵坐标。每个样采集10，000 events。

1.3 荧光显微镜分析

1) 滴一滴用Annexin V-FITC/PI双染的细胞悬液于载玻片上，并用盖玻片盖上细胞。

2) 在荧光显微镜下用双色滤光片观察。Annexin V-FITC荧光信号呈绿色，PI荧光信号呈红色。