Yefluor 647 Edu细胞成像试剂盒（远红外色荧光）

产品信息

产品描述

细胞增殖检测是评估细胞健康程度、遗传毒性及抗肿瘤药物效果的基础实验手段。常用的检测细胞增殖方法是BrdU法。EdU法检测是Brdu方法的升级和突破。EdU（5-溴-2-脱氧尿嘧啶）是一种嘧啶类似物，可在DNA合成期整合入DNA双链。EdU法检测是基于“点击”反应，一种由铜催化的叠氮化合物和炔烃的原子共价反应。

试剂盒中EdU试剂含有炔烃，而Yefluor 647 Azide染料试剂含有叠氮化合物。点击法的EdU标记增殖快速有效，易于使用。只需少量的叠氮化染料即可有效地标记出整合的EdU。标准化的戊二醛固定和去污剂促渗可以使检测试剂进入细胞，而Brdu方法则需要DNA变性（如酸变性、热变性或者用DNase消化）去暴露BrdU，从而方便BrdU抗体结合。

本试剂盒包含EdU法检测所需要的所有组份，可以检测细胞增殖与细胞周期分析。对于细胞周期的分析，试剂盒提供了细胞核染料Hoechst 33342。

光谱特性：Yefluor 647 Azide：Ex/Em=650/670 nm；Hoechst 33342：Ex/Em=350/461 nm, bound to DNA。

产品组分

运输与保存方法

冰袋（wet ice）运输。-20℃避光保存，有效期1年。

注意事项

操作时请采取防护措施，穿防护服、戴一次性手套等。

其他所需试剂

10 mM PBS, pH7.2-7.6

中性多聚甲醛固定液（4%多聚甲醛 in PBS ）

2 mg/ml 甘氨酸溶液（去离子水配制）

促渗试剂（0.5% Triton X-100 in PBS）

3% BSA in PBS, pH7.2-7.6

去离子水

18×18 mm 盖玻片

使用方法

1、EdU标记细胞

注意：EdU的标记浓度应根据所用的细胞类型做相应的优化选择，推荐客户以10 μM的EdU初始浓度进行摸索。细胞培养基、细胞生长密度及细胞类型和其他实验条件都有可能影响细胞的标记效果。预实验中我们建议客户设置一系列的EdU浓度梯度，以确定最佳的合适您的细胞的实验浓度。

1.1 以每孔4×103-1×105细胞接种于96孔板中，进行您所需要的药物处理或者其他刺激处理。

1.2 准备一份2×的EdU工作液（组分A）：以完全培养基稀释10 mM的储液至合适的工作浓度。建议您以10 μM的初始工作浓度开始预实验。

1.3 预热2×的EdU工作液，加入等体积的培养基，使浓度变为1×(如：需要得到10 μM的终浓度，应以新鲜培养基等体积加入到20 μM的EdU工作液中)。

1.4 合适时间合适条件孵育细胞，EdU孵育细胞的时间可以直接用作测定细胞DNA合成的指标，时间点选择以及孵育时间的长度取决于细胞生长速率。通过短暂的EdU孵育进行的脉冲式标记细胞可以用于研究细胞周期动力学。

2、细胞固定及促渗操作

2.1 孵育完成后，去除培养基加入50 μL 4%中性多聚甲醛至各个孔，室温孵育15-30 min后，去除固定液。

2.2 每孔加入50 μL 2 mg/mL甘氨酸溶液，室温孵育5 min，中和残留的固定液。

2.3 以每孔0.1 mL 3% BSA in PBS的洗涤液洗涤细胞2次。

2.4 去除洗涤液，加入0.1 mL 0.5% Triton X-100 in PBS到每个孔中，室温孵育20 min。

注意：本参考步骤是针对以4%中性多聚甲醛固定且以0.5% Triton X-100促渗操作样本而优化的操作方法，但本参考所介绍的步骤同样可用于其他类似操作的样本，如以甲醇固定以皂苷固定的样本等。

3、EdU检测

注意：本参考步骤每孔反应使用100μL的Click-iT反应混合物。用户可以根据自己的样本情况调整等比例减少所用的溶液体积。

3.1 准备1× Click-iTEdU反应缓冲液（组分C）：10×组分C试剂以去离子水稀释10倍即可。

3.2 制备一份5×的Click-iTEdU反应添加物储液（组分E）：加0.3 mL去离子水至30 mg的E组分试管中（100 mg/mL），混匀至全部溶解。使用后，剩余储液存放在≤-20℃，可保存一年，溶液一旦呈现棕色，则说明有效成分降解不能再用（注意：不同规格的组分E均按照此比例加去离子水溶解为5×储液备用）。

3.3 准备1× Click-iTEdU缓冲液添加物：以去离子水稀释5×储液（组分E）至1×，溶液应新鲜配置，当天用完。

3.4 依据表1准备Click-iT反应混合物。表1要求添加的组分对于反应来说非常重要，否则反应无法有效进行。

表1 Click-iT反应混合物

3.5 去除促渗剂，以每孔0.1 mL的3% BSA in PBS的洗涤液洗涤2次，去除洗涤液。

3.6 加入0.1 mL Click-iT反应混合物至每个孔，简短摇晃培养板以确保反应混合物可以均匀覆盖细胞。

3.7 室温避光孵育30 min。

3.8 除去反应混合物，每孔以0.1 mL 3% BSA in PBS洗涤两次，去除洗涤液。

对于核染色，可以进行DNA复染。如其他无特别要求，即可进行拍照分析。

4、 DNA复染（可选）

4.1 以0.1 mL PBS洗涤每孔1次，去掉洗涤液。

4.2 以PBS稀释Hoechst 33342（组分F）储液1:2000至1× Hoechst 33342溶液，终浓度为5 µg/mL。

4.3 每孔加0.1 mL 1× Hoechst 33342溶液，室温避光孵育15-30 min。除去Hoechst 33342溶液。4.4 0.1 mL PBS洗涤每孔2次，去除洗涤液。