5-bromo-2'-deoxyuridine (BrdU) 5-溴脱氧尿嘧啶核苷

产品信息

产品描述

目前常用的细胞增殖标记物有4种，DNA聚合酶α（DNA polymerase α），增殖细胞核抗原（Proliferating cell nuclear antigen，PCNA），Ki-67和5-溴脱氧尿嘧啶核苷（Brdu）。其中Brdu为组织细胞非内源性表达存在，应用相对较广。Brdu，也称为溴化去氧尿苷，一种合成的胸苷类似物，在S期可替代胸腺嘧啶核苷选择性结合到细胞DNA中。从而检测细胞DNA合成和标记细胞分裂，凋亡等行为。在遗传研究中Brdu可通过活体注射或细胞培养加载，然后使用抗Brdu的单克隆抗体进行特异性标记，ICC或IHC法染色法显示增殖细胞。另外，还能同时结合其它细胞标记物，双重染色，来判断增殖细胞的种类，增殖速度等，对研究细胞动力学有着重要意义。

产品性质

运输和保存方法

冰袋运输。-20℃干燥保存，2年有效。

操作步骤

1. Brdu储存液的准备用1X DPBS充分溶解适量的Brdu配置10 mg/mL的母液，过滤除菌后，按照0.5mL/管的量分装放在-20°C或者-80°C长期保存，避免反复冻融。Brdu储存液再融化后，4°C可稳定存放一周。
1.       体内Brdu标记

1）腹腔注射法（常用）：无菌的10 mg/mL（溶于DPBS）适合用于体内注射用。按照100-200 μL（1-2 mg） Brdu的量腹腔注射到小鼠体内。注意：最短在注射后0.5 h后在小肠，胸腺和骨髓瘤处就能检测到Brdu。而一般在注射后24 h内几乎所有组织都能检测到Brdu。这个时间可能对于一些快速分化的组织如小肠来说有些久。

2）根据自身的实验体系，在合适的时间点处死动物，摘除待研究的组织。使用冰冻切片或者石蜡包埋的方法进行组织处理和切片制备。然后进入后续的IHC染色步骤。

2. 体外Brdu标记（培养原代细胞或者细胞系）

注：总的来说，10 μM Brdu（稀释于培养液）是一个比较合适的方法用来标记不同物种来源的原代细胞或细胞系。当然，建议针对具体的实验体系优化方法。

1）在96孔板上按标准步骤进行细胞培养，培养时间一般为1-72 h；

2）Brdu工作液的准备：用组织细胞培养液按照1:30的比例稀释储存液得到1mM Brdu工作液。然后取10 μL 1 mM Brdu溶液直接加入1 mL组织培养液即得到最终工作液。37°C温热。

3）按100 μL/孔Brdu工作液的量进行细胞标记，37°C孵育60 min~过夜。同时设置非Brdu标记的细胞作为阴性对照。注意：最佳的孵育时间取决于细胞增殖速度以及需要达到的实验目的。比如，对于快速增殖细胞（如HL-60）有效孵育时间为30-45 min；对于原代细胞（如未受外源刺激培养的外周血淋巴细胞）孵育时间可能需要24 h。细胞密度最好不要超过2x10⁶ cells/mL。

4）制备单细胞层玻片，使用以下任何一种方法：

a.           细胞离心涂片（cytospin）制备：使用细胞离心涂片机，将100 μL标记好的细胞（浓度为：1-2 x10⁶ cells/mL）直接离心到干净，无脂肪，poly-L-lysin包被的玻片上，风干。

b.           细胞涂片（cell-smear）制备：取一小滴标记好的细胞悬液于干净，无脂肪，poly-L-lysin包被玻片的一端，然后用第二个干净玻片将其均匀涂布成一薄层。室温风干。

5）将玻片置于70%冰乙醇放在-20°C下固定20-30 min。

6）PBS清洗细胞3次，每次5 min。

7）加入1.5M HCl中室温孵育30 min。注意：DNA的变性对于Brdu染色的成功至关重要。

8）吸去HCl，PBS清洗2次，每次5 min。

9）进入后续ICC染色步骤。

3. 体外Brdu标记（组织薄片）

1）Brdu工作液的准备：用组织细胞培养液按照1:30的比例稀释储存液得到1 mM Brdu工作液。然后取10 -20 μL 1 mM Brdu溶液直接加入1 mL组织培养液即得到最终工作液。确保有足够的工作液（37°C温热）完全浸泡组织。

2）用手术刀或者锋利的刀片将组织切割成约1 mm厚，2 mm²大小的薄片。建议在温热的培养基内进行切片，利于维持组织的活力。

3）转移组织薄片至预装有10 mL Brdu标记液的15 mL离心管内。于37°，CO₂ 培养箱内孵育需要的时间。孵育时间可变，取决于组织薄片类型以及需要达到的实验目的（常用的为2-4 h）。直接丢弃未用完的标记液。

4）37°C PBS清洗组织薄片，每次5 min。

5）使用标准的冰冻切片或者石蜡包埋切片的方法固定组织。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2）该品对肌体有不可逆损伤的可能性。使用时应穿防护服和戴手套。应避免吸入本品的粉尘。