Hieff NGS® Fast-Pace DNA Ligation Module 快速DNA连接模块

产品信息

产品描述

Hieff NGS^® Fast-Pace DNA Ligation Module是针对Illumina®高通量测序平台文库构建专业设计的DNA连接模块。本产品可在双链平末端DNA片段或双链3´-dA DNA片段的两端连接Illumina®测序平台适用的DNA接头，具有连接效率高、简便、可实现自动化等优势。本产品已与Hieff NGS® End Repair/dA-Tailing Module（Cat#12608），2×Hieff Canace®Ⅱ High-Fidelity Mix for Library Amplification（Cat#12621）共同用于DNA文库构建，通过Illumina®高通量平台测序验证其有效性。本产品中提供的所有试剂组分，都经过严格的质量与功能验证，最高程度保障产品优异性能与批间稳定性。

产品组分

质量控制

Fast Pace T4 DNA Ligase

1. SDS-PAGE纯度：>95%。

2. 16小时孵育检测：50 μL反应体系中包含5μl本酶和1 μg HindIII-λDNA，37°C下孵育16小时。经琼脂糖凝胶电泳检

测，条带无降解；50 μL反应体系中包含5μl本酶和1 μg T3 DNA，37°C下孵育16小时。经琼脂糖凝胶电泳检测，条

带无降解。

3. RNase活性：5μl本酶中加入40 ng FAM-RNA及，37°C下孵育16小时。经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，条带无降解。

4. 核酸内切酶活性：50 μL反应体系中加入5μl本酶和1 μg φX174 RF I DNA，37°C下孵育4小时。经琼脂糖凝胶电泳

检测，RF II转化比率<10%。

5. 核酸外切酶活性：50 μL反应体系中加入至少5μl本酶和1 μg声振的[3H]DNA（105 cpm/μg），37°C下孵育4小时，

释放的放射性<0.1%。

6. 功能活性（平末端连接）：50 μL反应体系，在1×Fast Pace Ligation Buffer中，加入0.5 µL Fast Pace T4 DNA Ligase，18 μg

HaeIII φX174，16°C孵育7.5分钟。经琼脂糖电泳检测，片段连接率>95%。

7. 功能活性（接头连接）：50 μL反应体系，在1×Fast Pace Ligation Buffer中，加入0.125 µL Fast Pace T4 DNA Ligase，8 nmol

12 bp接头，16°C孵育过夜。经琼脂糖电泳检测，无明显未连接接头。

Fast Pace Ligation Buffer

1. 16小时孵育检测：50 μL反应体系中包含1×Fast Pace Ligation Buffer和1 μg HindIII-λDNA，37°C下孵育16小时。经琼

脂糖凝胶电泳检测，条带无降解；50 μL反应体系中包含1×Fast Pace Ligation Buffer和1 μg T3 DNA，37°C下孵育16小时。

经琼脂糖凝胶电泳检测，条带无降解。

2. 核酸内切酶活性：50 μL反应体系中包含1×Fast Pace Ligation Buffer和1 μg φX174 RF I DNA，37°C下孵育4小时。经

琼脂糖凝胶电泳检测，RF II转化比率<10%。

3. RNase活性：在1×Fast Pace Ligation Buffer中加入40 ng FAM-RNA，37°C下孵育16小时。经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，

条带无降解。

4. 磷酸酶活性检测：在磷酸酶活性检测缓冲液中加入1×Fast Pace Ligation Buffer和2.5 mM对硝基苯磷酸，37°C下孵育4

小时。经光谱测定法检测，405 nm处无对硝基苯阴离子特征吸收峰。

测序验证

本品与Hieff NGS® End Repair/dA-Tailing Module（Cat#12608），2×Hieff Canace®Ⅱ High-Fidelity Mix for Library Amplification（Cat#12621）共同用于DNA文库构建，通过Illumina®高通量平台测序验证其有效性。

运输与保存方法

冰袋运输。

-20℃保存，效期一年。

注意事项

为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

使用方法

1. Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。Adapter用量过高可能会产生较多Adapter Dimer；用量较低可能会影响连接效率及文库产量。表1列举了使用本试剂盒，不同Input DNA量推荐的Adapter使用量。

                                        表1  500 pg-1 μg Input DNA推荐的Adapter使用浓度

【注】：Input DNA摩尔数（pmol）≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度（bp）]。

2. 目前主流的合并法DNA建库试剂盒，其末端修复和加A处理后一般不纯化，直接进行接头连接。本试剂盒可与主流的商业化末端修复加A体系兼容，进行接头连接。反应体系请参考如下配制，并涡旋混匀几秒钟，瞬离后至于20℃，反应15分钟即可。

     表2Adapter Ligation体系

【注】：*对于Ligation Enhancer，请上下颠倒、振荡，充分混匀并瞬时后离心使用。

**根据自身需求加入适量的接头。

【接头添加计算举例】：当Input DNA为100 ng，Input DNA长度为300 bp时，接头应该添加多少？

第一步，计算Input DNA摩尔数。公式：Input DNA摩尔数（pmol）≈ Input DNA质量(ng)/ [0.66 × Input DNA平均长度（bp）]；

Input DNA 摩尔数（pmol）=100÷（0.66×300）=0.5 pmol；

第二步，计算接头添加摩尔数。根据注意事项三表2查询接头添加比例；

根据表2，查得Input DNA 100ng时接头添加比例100:1，则接头添加摩尔数=100×0.5 pmol=50 pmol；

第三步，计算接头添加体积。接头浓度=15 μmol/L（如使用其他接头，浓度需要依据其他接头浓度参数）；

接头添加体积=接头添加摩尔数（50 pmol）÷接头浓度（15 μmol/L）=3.34 μL（注：15 μmol/L=15 pmol/μL）

综上，接头可添加3.4 μL，加1.6 μL水补齐至5 μL。（注：接头最大加入体积不超过5 μL）