Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix (抗体法，Low Rox) - qPCR系列 - 分子生物学 - 产品中心 - 上海钰博生物科技有限公司

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本产品是2×实时定量PCR扩增的预混合溶液。具有高特异性和高检出率的特点。采用的抗体法热启动Taq DNA聚合酶，在预变性温度（95℃）加热30 sec，急速释放出Taq DNA Polymerase活性。UNICON® Taq抗体可以有效抑制样品准备过程中引物退火导致的非特异性扩增。同时配方额外添加了有效抑制非特异性PCR扩增的组分和均衡不同GC含量（30%-70%）基因扩增的促进因子。使定量PCR结果可以在宽广范围内更加真实有效。

预混液含有所有PCR扩增的组分。使用时，仅需在扩增体系中加入模板和引物即可进行实时荧光定量PCR，大大简化操作过程，降低污染几率。

运输与保存方式

冰袋运输。-20℃避光储存，有效期18个月。

本品避免反复冻融。产品中含有荧光染料SYBR Green I，保存或配制反应体系时需避免强光照射。

注意事项

1. 推荐使用本公司cDNA合成试剂盒（货号：11123ES），以有效去除RNA样品中残留的基因组。

2. 产品解冻后如果发现不溶物，请上下颠倒混匀至溶液澄清，不影响试剂性能。

3. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

反应体系（推荐冰上配制）

组分	体积（μl）	体积（μl）	终浓度
Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix (抗体法，Low Rox)	25	10	1×
Forward Primer (10 μM)	1	0.4	0.2 μM
Reverse Primer (10 μM)	1	0.4	0.2 μM
模板DNA	X	X	-
无菌超纯水	to 50	to 20	-

【注】：使用前务必充分混匀，避免剧烈震荡产生过多气泡。

a) 引物浓度：通常引物终浓度为0.2 μM，也可以根据情况在0.1-1.0 μM之间进行调整。

b) 模板浓度：如模板类型为未稀释cDNA原液，使用体积不应超过qPCR反应总体积的1/10。

c) 模板稀释：cDNA原液建议5-10倍稀释，最佳模板加入量以扩增得到的CT值在20-30个循环为好。

d) 反应体系：推荐使用20 μl或50 μl，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

e) 体系配制：请于超净工作台内配制，并使用无核酸酶残留的枪头、反应管；推荐使用带滤芯的枪头。避免交叉污染和气溶胶污染。

扩增程序（两步法）				扩增程序（三步法）
循环步骤	温度	时间	循环数	循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	30 sec	1	预变性	95℃	30 sec	1
变性	95℃	10 sec	40	变性	95℃	10 sec	40
退火/延伸	60℃	30 sec★	40	退火	55-60℃	20 sec
熔解曲线阶段	仪器默认设置		1	延伸	72℃	20 sec★
熔解曲线阶段	仪器默认设置		1	熔解曲线阶段	仪器默认设置		1

【注】：高特异性可选择两步法，高效率扩增可选择三步法。

a) 预变性时间：本反应条件适合大多数基因扩增，如果遇到含有复杂结构的基因可适当增加预变性时间至3-5 min。

b) 退火温度和时间：请根据引物和目的基因的长度进行调整。

c) 荧光信号采集（★）：请按照仪器使用说明书要求进行实验程序设置，几种常见仪器的时间设定如下:

30 sec以上：Applied Biosystems: StepOne, StepOne Plus, 7500 Fast；Roche Applied Science:LightCycler 480；Bio-Rad: CFX96

31 sec以上：Applied Biosystems: 7300

34 sec以上：Applied Biosystems: 7500

d) 熔解曲线：通常情况下可以使用仪器默认程序。

结果分析

定量实验至少需要三个生物学重复。反应结束后需要确认扩增曲线及熔解曲线。

1) 扩增曲线：标准扩增曲线为S型。

Ct值落在20-30之间时，定量分析最准确；

Ct值小于10，需要将稀释模板后，重新进行实验；

Ct值介于30-35之间时，需要提高模板浓度，或者增大反应体系的体积，以提高扩增效率，保证结果分析的准确性；

Ct值大于35时，检测结果无法定量分析基因的表达量，但可用于定性分析。

2) 熔解曲线：

熔解曲线单峰，表明反应特异性好可以进行定量结果分析；若熔解曲线出现双峰或者多峰，则不能进行定量分析。

熔解曲线出现双峰，需要通过DNA琼脂糖凝胶电泳判断非目标峰是引物二聚体还是非特异性扩增。

如果是引物二聚体，建议降低引物浓度，或者重新设计扩增效率高的引物。

如果是非特异性扩增，请提高退火温度，或者重新设计更高特异性的引物。

引物设计指南

1）推荐引物长度25 bp左右。扩增产物长度150 bp为佳，不要低于100 bp，可以在100 bp-300 bp内选择。

2）正向引物和反向引物的Tm值相差不宜超过2℃。引物Tm值60℃-65℃为佳。

3）引物碱基分布要均匀，避免出现连续的4个相同碱基，GC含量控制在50%左右。3’端最后一个碱基最好为G或C。

4）引物内部或者正反两条引物间最好避免出现有3个碱基以上的互补序列。

5）引物特异性需要用NCBI BLAST程序进行核对。避免引物3’端有2个碱基以上的非特异性互补。

6）设计完成的引物需要进行扩增效率的检测，只有具备相同扩增效率的引物才可用于定量比较分析。

适用机型

Applied Biosystems: 7500, 7500 Fast, ViiA 7, QuantStudio Dx, QuantStudio 3 and 5, QuantStudio 6,7,12k Flex;

Stratagene: MX3000P, MX3005P, MX4000P.

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产品名称	产品编号	规格	价格（元）	促销价（元）
Hieff UNICON® Power qPCR SYBR Green Master Mix (抗体法，Low Rox)	YB005P	1 ml	383.00	223.00
	YB005P	5×1ml	1653.00	663.00
	YB005P	5×5 ml	6933.00	3483.00
	YB005P	10×5 ml	12533.00	6613.00
	YB005P	20×5 ml	19833.00	12563.00

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