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Plant Tissue Direct PCR Kit

Product Introduction

Plant Tissue Direct PCR Kit

产品信息

产品名称	产品编号	规格	价格（元）
Plant Tissue Direct PCR Kit	YB041P	50 T	353.00
Plant Tissue Direct PCR Kit	YB041P	200 T	1213.00

产品描述

植物组织直接PCR试剂盒是一款可直接对不同类型植物叶片进行PCR扩增的试剂盒，适应性广、稳定性强。试剂盒采用独特的裂解缓冲液体系，可以快速的裂解多种植物样品并释放出基因组DNA，不需要除去蛋白、RNA或次生代谢产物等，即可将释放出的基因组DNA作为模板直接用于PCR反应。此外，样品使用量少，低至1 mg植物叶片即可进行实验。

本试剂盒中提供的2× Plant Master Mix具有很强的扩增兼容性，能直接以待测样品裂解液为模板，进行高效特异性扩增。该试剂为2倍浓缩PCR反应混合液，包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分，大大简化操作过程，降低污染几率。
该试剂盒可用于转基因植株鉴定、植物基因分型等。

产品组分

类别	编号	组分	产品编号/规格		储存
类别	编号	组分	YB041P（50 T）	YB041P（200 T）	储存
Part I	10183-A	Buffer P1	3 mL	10 mL	室温或4℃
	10183-B	Buffer P2	3 mL	10 mL	4℃
	10183-C	6× DNA Loading Buffera	1.5 mL	1.5 mL	4℃或-20℃
Part II	10183-D	2× Plant Master Mixb	500 μL	1 mL×2	-20℃

a）6× DNA Loading buffer：不含SDS。

b）2× Plant Master Mix：包含热启动Taq DNA聚合酶、dNTP混合物、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂以及稳定剂等。

运输方法

冰袋运输。

保存方法

1. 试剂10183-A【Buffer P1】，在常温干燥条件下，可保存12个月，如需保存更长时间可置于4℃。低温保存，易出现沉淀，可平衡至室温或37℃水浴10 min，待沉淀溶解后，混匀使用。

2. 试剂10183-B【Buffer P2】，中和裂解产物，使其不影响后续 PCR 反应。保存条件与Buffer P1一样。
3. 试剂10183-C【6× DNA Loading Buffer】，可置于4℃或-20℃长期保存。

4. 试剂10183-D【2× Plant Master Mix】，-20℃保存，避免反复冻融。如果环境温度过高，2× Plant Master Mix 可能会变浑浊，可置于冰上放置1-2 min，待溶液澄清，上下颠倒混匀3-5次后再使用。

操作方法

本试剂盒根据不同实验需求提供了两种操作方法。直接法仅需要将一小片植物组织加入PCR反应体系即可；裂解法则是将少量含有植物组织的裂解产物加入PCR反应体系。其中，裂解法适合目的片段较长，扩增难度较大，以及需要对同一样本进行多次PCR扩增的实验。

裂解法

1. 取3-5 mg叶片（直径5-7 mm）组织，置于200 μL或1.5 mL离心管中。

注：切勿加入过量叶片组织，以便酶解反应更顺利进行。

2. 在离心管中加入50 μL Buffer P1，确保裂解液能够完全浸没叶片组织。

3. 盖好离心管盖，95℃处理10 min。

注：加热后，若管壁上液体较多，可进行短暂瞬时离心。

4. 加入50 μL Buffer P2，用微量移液器吹打或者涡旋混匀。

5. 所得裂解液可4℃保存（5天）或-20℃长期保存或直接用于PCR扩增。

直接法

1. 在200 μL离心管中加入相应的2× Plant Master Mix，再添加对应的引物，并用ddH2O使其稀释1×（PCR体系配置见下表）

2. 剪取1-2 mg叶片碎块（直径2-3 mm）加入配置好的1×PCR反应体系。

注：确保叶片碎块完全被PCR反应液浸没，切勿加入过量组织叶片。

3. 根据优化好的PCR条件（退火温度等）进行PCR反应。

4. 琼脂糖凝胶电泳检测结果。

注：建议使用试剂盒提供的6× DNA Loading Buffer，切勿使用含有SDS的Loading Buffer进行电泳。

PCR反应鉴定——PCR反应体系

组分	体积（μL）	体积（μL）	终浓度
2× Plant Master Mix	10	25	1×
Forward Primer (10 μM)	0.5	1	0.2-0.25 μM
Reverse Primer (10 μM)	0.5	1	0.2-0.25 μM
裂解产物（DNA模板）	4	10	-
ddH2O	To 20	To 50	-

注：各组分使用前应充分混匀。

a）模板使用量：建议10-20%总体系。避免超过总体系的30%。

b）引物终浓度：0.2-0.25 μM可以得到较好结果。反应性能较差时，可在0.1-0.5 μM范围内调整引物浓度。

c）反应体系：推荐使用20 μL或50 μL，以保证目的基因扩增的有效性和重复性。

d）体系配制：配制好PCR反应体系，置于涡旋仪上涡旋混匀，瞬时离心将反应液集于管底。

e）对照反应：建议进行PCR时，设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。

PCR反应鉴定——PCR反应条件

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	94℃	5 min	1
变性	94℃	10 sec	30-40
退火	50-65℃	20 sec
延伸	72℃	30 sec/kb
终延伸	72℃	5 min	1

注：

a）退火温度：请参考引物的理论 Tm 值，退火温度可设置低于引物理论值 2-5℃。

b）延伸时间：需要根据片段的长度来确定，对于1 kb以内的DNA片段，建议延长时间为30 sec。

注意事项

1. 本试剂盒只适合于多糖多酚含量低的植物叶片样本，如小麦、水稻、烟草、玉米、大豆、油菜等。不适合多糖多酚含量高的植物样本。

2. 建议使用新鲜采取的叶片组织，若为长期冷冻组织，应尽量避免反复冻融，否则会导致模板的降解，影响PCR效率。叶片组织以幼嫩为宜，若为成熟的叶片，避免使用叶片主脉部位组织。

3. 电泳检测时，切勿使用含有SDS的Loading Buffer。否则，电泳时会在泳道中出现一大团拖尾亮带，影响实验结果。

4. 建议扩增片段长度1 kb以内，以便扩增效率最佳。

5. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

常见问题与解决方法

常见问题	可能原因	解决方法
阳性对照、待测样本均无条带。	PCR反应体系或反应条件不合适。	使用梯度PCR摸索PCR最佳反应条件。
	PCR试剂保存不当失去活性。	2× PCR Mix应保存于-20℃，使用时避免反复冻融。若使用频繁，可在4℃短时间存放。
	引物设计问题。	尝试重新设计引物进行检查。
阳性对照有目的条带，待测样本无条带或条带弱。	叶片中多糖多酚含量较高，裂解混合液呈棕黄色甚至棕红色。	本试剂盒不适合多分多糖含量较高的样品。
	裂解液、中和液加入比例不当，裂解混合液影响PCR体系的pH值。	正常条件下，中和后的裂解混合液的 pH 应该在7-8左右(裂解产物和Buffer P2严格按照1:1的量进行中和)。
	样本裂解混合液保存不当或保存时间过久，DNA基因组已经降解。	裂解混合液液可在4℃保存5天，尽量使用新制备的裂解液混合液进行PCR。
	模板加入量不适合。	在反应体系5-20%范围内优化模板加入量。
	PCR循环数不足。	适当增加PCR的循环数，推荐35-40循环为佳。因模板复杂，一般PCR反应要比用纯化的DNA模板多5-10个循环为佳。
非特异性扩增	PCR退火温度太低，循环数、引物浓度或模板浓度太高。	增加PCR退火温度，降低PCR循环数、引物浓度或模板浓度。
	PCR引物错配。	重新设计PCR引物。
	配制PCR反应体系时温度太高或配制完成后放置时间太久。	PCR反应体系的配制在低温下进行，配制完成后尽快进行PCR扩增反应。
阴性对照出现目的条带	操作工具或试剂污染。	实验所有试剂或器材均应高压灭菌。操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。
阴性对照出现目的条带	样本间交叉污染。	每个取样器只对一个样本使用；或取完一个样本后，将取样器刃口浸入2%的次氯酸钠溶液中，反复涮洗，然后用干净的纸巾擦干残液。