两步法荧光定量RT-PCR试剂盒

产品及特点本试剂盒是整合 cDNA 一链合成试剂（RT 试剂盒）和即用型 qPCR 试剂而得的 qRT-PCR 试剂盒。cDNA 一链合成反应和 qPCR 反应分别在两个离心管中进行。本试 剂盒具有下列特点：

1. 即开即用，足够 50 次 RT 反应（10uL 体系）和 50 次 qPCR 反应（20 uL 体系）。

2. RT 和 PCR 分开进行，方便优化 RT 和 qPCR 条件，也方便一个 RT 反应用于多个不 同引物的 qPCR 扩增。

3. RT mix 中含除酶、模板和引物以外的 RT 成分，简化了反应设置步骤。

4. qPCR mix 是 2×预配液，也简化了反应设置步骤。

5. qPCR mix 含 qPCR 染料，无需另外加入相关荧光 PCR 染料。

6. 扩增效率高, 最长可扩增 5 Kbp 以上的 RNA。

7. 提供定量 PCR 专用模板稀释液，保证在制作标准曲线时低浓度样品的准确性。
规格及成分 成 分 编 号 十孔盒包装
2×RT Mix 60906a 40 uL（黄盖）
MMLV 逆转录酶 (含 RI) 60906b 10 uL（红盖）
2×qPCR MagicMix 90805 1 mL（棕色管）
定量 PCR 专用模板稀释液 180701 1 mL（绿盖）
RNase-free 水 80403 1 mL（蓝盖）
使用手册 101219sc 1 份

运输及保存 低温运输,-20℃保存, 有效期一年。

自备试剂 样品 RNA、PCR 引物、ROX 染料 使用方法

一、样品 RNA 的制备（本试剂盒不提供相关试剂）

1、可用自本公司各种 RNA 提取方法提取样品的 RNA，也可以选用其他供应商的产品，但 得到的 RNA 一定要溶解在 RNase-free 的超纯水中。

2、如果需要用 RNA 制备标准曲线，则需在此步用定量 PCR 专用模板稀释液将 RNA 样品 稀释不同梯度，并分别作为下步 RT 反应的模板。

3、由于污染的 gDNA 会严重影响 RNA 的定量，因必须彻底去除 RNA 样品中的 gDNA 污 染。用户可以另购 RNase-free DNase 来消化 RNA 样品，也可以合成只识别外显子的 引物。 

二：RT（逆转录）反应合成 cDNA

4、按下表配制 RT 反应体系（10 uL 体系），在每个管中加入下列成分: 成分 加入量 总 RNA 100-500 ng 2×RT mix 4 uL MMLV 逆转录酶 1 uL RNase-free 水 补到 10 uL

5、42℃保温 60 分钟。此步为 RT 反应。

6、85℃保温 5 秒以终止反应，然后放置在冰上待用。

7、合成的 cDNA 可以直接作为下步 qPCR 模板使用，不需要纯化。剩余样品可以放置在 -20℃长期保存。如果需要用 cDNA 制备标准曲线，则需在此步用定量 PCR 专用模板 稀释液将 cDNA 样品稀释不同梯度，并分别作为下步 qPCR 反应的模板。

三、qPCR（20 uL 体系）

8、在每个 PCR 管中加入下列成分： 成分 加入量 qPCR MagicMix 10 uL cDNA 样品（来于上步的 RT 反应） 2 uL PCR 正向引物(10 pmol/uL) 1 uL PCR 反向引物(10 pmol/uL) 1 uL 自备 ROX 染料 I 或 II（见注） 2 uL RNase-free 水 4 uL

注意：如果使用 ABI 公司的 7500，7700 和 7900 三种型号的荧光 PCR 仪器，则需 用自备的 ROX 进行 Ct 值校正。对 ABI 7700 和 7900，ROX 的佳浓度为 1×（即 在每 20 uL 反应体系中加 2 uL 10×ROX）。对 ABI 7500， ROX 的佳浓度为 0.05-0.1×（每 20 uL 反应体系加 0.1-0.2 uL 10×ROX；也可将 10×ROX 稀释到 1×，然后每个反应体系加入 1-2 uL 1×ROX）。ROX 会在溶解曲线中产生噪音，因 此，如果出现了杂峰，将软件中“Passive Reference Dye”中的“ROX”选项取消打 勾，然后重新分析数据。 对于iCycler IQ，MJ Opticon，MJ Chromo4，MX3000，MX4000, RotorGene3000， RotorGene 6000 和 LightCycler 480 等型号的荧光 PCR 仪器，ROX 不是必须的， 但加入的话也不会影响整个 PCR 分析。 

9、PCR 反应参数(需要用户根据模板和引物决定，下面参数的只做参考)： 过程 温度 时间 预变性 94℃ 5 min PCR 反应 （40 个循环） 94℃ 1 min 55℃ 1 min 72℃ 2 min 后延伸 72℃ 10 min

10、 实验结果分析：反应结束后确认扩增曲线和溶解曲线，制作标准曲线。具体方法 随仪器不同而不同，请参考 qPCR 仪器手册。