KOD DNA聚合酶

产品及特点 KOD DNA Polymerase 是从克隆有 Thermococcus kodakaraensis DNA聚合酶基因的质粒在大肠杆菌中经诱导表达分离纯化而来。该酶所具有的超强 3’→ 5’外切酶活性使得其扩增保真性比 Pfu DNA Polymerase 更高，保真性是 Taq的约 50 倍，同时具有合成速度快的特点，聚合速度约为普通 Pfu DNA Polymerase的 5 倍，Taq DNA Polymerase 的 2 倍，达到 100-138 bp/秒，可以在短时间内获得高产量的扩增产物，特别适合于高保真地扩增 6 kb 以内的 PCR 产物，扩增所得的 DNA 为平末端，可用于基因克隆、表达及突变分析等分子生物学实验。

规格及成分 成 份 编 号 塑料袋包装

KOD DNA 聚合酶 (5 U/uL) 101002a 50 uL

10×KOD DNA 聚合酶缓冲液 101002b 1.0 mL

使用手册 101002sc 1 份

运输及保存 低温运输，-20℃保存、有效期一年。

自备试剂 DNA 模板、引物、超纯水

使用方法 一、建议PCR条件（以50 μL反应体系为例）

注：实际操作中计算好需补加水的量后，建议先加水，然后按上述顺序添加其它成分，最后添加KOD DNA聚合酶。最好在冰浴上混合PCR各种成分，防止KOD DNA聚合酶降解引物和模板。待各成分充分混匀后，离心数秒，使反应混合物沉到管底。然后将反应管置于PCR仪中进行扩增。

二、关于PCR条件的优化

成分 体积 终浓度

模板 - ＜0.5μg

正向引物（10 μM） 1 μL 0.2 μM

反向引物（10 μM） 1 μL 0.2 μM

10×KOD DNA 聚合酶缓冲液 5 μL 1×

dNTP Mixture（10mM each） 1 μL 0.2 mM

KOD DNA 聚合酶 0.25-0.5 μL

（1.25-2.5U）-超纯水 补足到 50 μL -

1. 质粒或者噬菌体模板（模板量5-20 ng，循环参数如下表）

2. 基因组DNA和cDNA模板（基因组DNA模板量为50-100 ng，1-2 μL cDNA

（起始转录用的RNA为500 ng），循环参数如下表）

循环参数 目标 DNA<2 kb

Step 1 94C 2 分钟

Step 2 94C 20-30 秒

Step 3 Ta 15-20 秒

Step 4 72C 20-60 秒

Step 5 72C 5 分钟

Repeat step 2-4 for 30-35 个循环

Ta= Tm - 5C

循环参数

目标 DNA<1 kb

目标 DNA<2 kb

目标 DNA3-4 kb

目标 DNA5-6 kb

Step 1 94C 2 分钟 94C 2 分钟 94C 2 分钟 94C 2 分钟

Step 2 94C 20 秒 94C 20 秒 94C 20 秒 94C 30 秒

Step 3 Ta 20 秒 Ta 20 秒 Ta 20 秒 Ta 30 秒

Step 4 72C 20 秒 72C 30 秒 72C 40 秒 72C 60 秒

Step 5 72C 5 分钟 72C 5 分钟 72C 5 分钟 72C 5 分钟

Repeat step 2-4 for 30-35 个循环

Ta= Tm－5C

相关资料 活性定义

1 U 指 75℃条件下，30 分钟内使 10 nmoles 的 dNTPs 掺入酸不溶性沉淀

物所需要的酶量。

问题解决 问题 可能的原因 解决方法

没有PCR产

物

设计的扩增靶序

列太长

设计稍短的扩增靶序列，以基因组DNA为模

板KOD适合扩增不超过2kb左右的产物，以

质粒和噬菌体DNA为模板适合扩增6 kb以

下的DNA。

PCR条带弥散

没有在冰上混合

PCR反应液

KOD扩增延伸速

PCR 反应液应该在冰上混合,KOD DNA聚合酶应该最后加，以防止KOD DNA聚合酶降解引物和模板。

度为1Kb/15-30秒，具有比其它聚合酶更快的延伸速度延伸时间过长，有时会有拖尾弥散效应。

如出现拖尾效应，可缩短退火延伸时间或者减少酶量。

低产量 模板为高GC含量

模板量太低

加入DMSO 2-5％，由于该酶的耐热性好，在应用于GC 含量高的模板等以及易产生高级结构的模板时，可在96℃以上进行变性。提高模板量