MMLV逆转录酶，200U/uL

产品及特点 该酶是突变型的 MMLV 逆转录 DNA 聚合酶，从表达 Moloney MurineLeukemia Virus （莫洛尼氏鼠白血病病毒）reverse transcriptase 基因(pol基因)的 E.coli 细胞中分离纯化而得，由一个分子量为 76.1 KDa 的单亚基组成，可催化以单链 DNA、RNA 或 DNA：RNA 杂交链为模板的互补 DNA 链的聚合反应。跟野生型相比,它没有 RNase H 活性。

1. 延伸性能好，没有 RNase H 活性，可合成长达 12.5 Kb 的全长 cDNA

2. 本产品提供的 MMLV 酶含 RNase Inhibitor，用户不需要单独准备。

3. 本产品提供的含 dNTP 的 4×MMLV Buffer，用户不需要单独准备。

4. 最佳反应温度为 42℃，但在 50℃时仍有活性，70℃10 分钟能使其失活。

5. 能以 Cy3-，Cy5-，rhodamine-， aminoallyl-，fluorescein 等标记的nucleotides 为底物。

6. 可用于 first strand cDNA 合成，second strand cDNA 合成，DNAlabeling，RNA primer extension 等。

7. 与 PCR 兼容，RT 产物可以用于 PCR 和 Real-time PCR。

8. 能被金属螯合剂，无机磷酸，焦磷酸和多胺抑制。

规格及成分 成 份 编号 塑料袋包装

MMLV 逆转录酶（含 RI），200U/μL 60905a 50 μL（黄盖）

4×RT Buffer（含 dNTP） 60905b 250 μL（白盖）

使用手册 60905sc 1 份

运输及保存 低温运输，-20℃保存，有限期一年

使用方法 一：合成 PCR 用的 1st-strand cDNA

1. 按下表配制 RT 反应体系:

成分 加入量

自备 RNA 模板

总 RNA 100-500 ng

或 poly(A) mRNA 10-500 ng

或专一的 RNA 0.01pg-500ng

注意：RNA 样品不能有基因组 DNA 污染。

自备引物

Oligo (dT)18(0.5ug/μL) 1 μL或随机引物(0.2ug/μL) 1 μL或 RNA 模板专一性引物 15-20pmol

注意：随机引物于 RNA 模板的比例跟最后得到的

cDNA 的平均长度成反比。

4×RT Buffer（含 dNTP） 5 μL

自备 RNase-free 水 补水到 19 μL

2. 70℃保温 5 分钟后立即冰浴。

3. 37℃保温 5 分钟。对富含二级结构的高 GC RNA 模板，可以改成

45℃保温 5 分钟。如果使用随机引物，则保温温度只能是 25℃（5分钟）。

4. 加入 1 μL (=200 U) MMLV 逆转录酶（含 RI），终体积为 20μL。

5. 42℃保温 60 分钟（但如果使用随机引物，需要先 25℃保温 10 分钟，然后再转移到 42℃保温 60 分钟）。

6. 70℃保温 10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作为 PCR 模板使用，不需要纯化。

二：合成建文库用的 1st-strand cDNA

1. 按下表配制 RT 反应体系:

成分 加入量

RNA 模板

或 poly(A) mRNA 1 ug

或专一的 RNA 0.5-1ug

注意：RNA 样品不能有基因组 DNA 污染。

引物

Oligo (dT)18(0.5ug/μL) 1 μL

或随机引物(0.2ug/μL) 1 μL

或 RNA 模板专一性引物 100pmol

注意：随机引物于 RNA 模板的比例跟最后得到的

cDNA 的平均长度成反比。

4×RT Buffer（含 dNTP） 5 μL

RNase-free 水 补水到 19 μL

2. 70℃保温 5 分钟后立即冰浴。

3. 37℃保温 5 分钟。对富含二级结构的高 GC RNA 模板，可以改成

45℃保温 5 分钟。如果使用随机引物，则保温温度只能是 25℃（5分钟）。

4. 加入 1 μL (=200 U) MMLV 逆转录酶（含 RI），终体积为 20μL。

5. 42℃保温 60 分钟（但如果使用随机引物，需要先 25℃保温 10 分钟，然后再转移到 42℃保温 60 分钟）。

6. 70℃保温 10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以用于第二链 cDNA 的合成或放置在-20℃。

相关资料 储存 Buffer：50 mM Tris-HCl (pH 8.3)，0.1 M NaCl，1 mM EDTA，5mM DTT，0.1% (v/v) Triton X-100 和 50% (v/v) glycerol。反应 Buffer，5X：250 mM Tris-HCl (pH 8.3 at 25℃)，250 mM KCl，20 mM MgCl2，50 mM DTT。

活性定义

以 poly(rA)为模板，以 oligo(dT)12-18为引物，在 37℃温度下，在 10 分钟将1 nmol 的 dTMP 掺入到多核苷酸中所需酶量为一个单位。酶反应条件为:50 mM Tris-HCl (pH 8.3)，6 mM MgCl2，10 mM DTT，40 mM KCl，0.5 mM dTTP，0.4 MBq/mL [3H]-dTTP，0.4 mM polyA•oligo(dT)12-18。

纯度

SDS-PAGE 考马市亮蓝染色无杂带污染