两管式RT-PCR试剂盒（AMV-Taq）

产品及特点本产品使用重组禽类成髓纤维病毒逆转录酶(Avian Myeloblastosis Virus Reverse Transcriptase, AMV RT)，从总 RNA 或者 Poly(A)+ RNA 合成一链 cDNA 的试剂盒， 含有 cDNA 一链合成所需的所有试剂。AMV RT 具有 RNA 聚合酶活性和 RNase H 的 活性，能够作用于 GC 含量高，二级结构复杂的 RNA。合成的一链 cDNA 可广泛应用于 第二链合成、杂交、PCR 扩增、Real-time PCR 反应等。

1. 即开即用，足够 50 次 RT 反应（20μL 体系）和 600 次 PCR 反应（30μL 体系）。

2. cDNA 一链合成试剂盒可灵活选用随机引物、Oligo dT 引物或基因专一引物，适合 各种情况。

3. 两管式操作，RT 和 PCR 在不同试管中进行，便于单独优化 RT 反应或 PCR 反应条件。

4. 全长的一链 cDNA 产量高，最长可合成 8 kb 的 cDNA。
规格及成分 成 分 编 号 十孔盒包装
AMV 逆转录酶 (含 RI) 130921a 50 μL
AMV RT Buffer（含 dNTP） 130921b 300 μL
Oligo (dT)18引物(0.5 μg/μL) 100814 50 μL
随机引物(0.5 μg/μL) 100409 50 μL
PCR MagicMix 3.0，含染料 90805 9 mL
RNase-free 水 80403 5 mL
使用手册 130921sc 1 份

运输及保存 低温运输,-20℃保存, 有效期一年。

自备试剂 样品 RNA、模板专一正向和反向引物。

使用方法 一、样品 RNA 的制备（本试剂盒不提供相关试剂）

1. 可用自本公司各种 RNA 提取方法提取样品的 RNA，也可以选用其他供应商的产品，但得到的 RNA 一定要溶解在 RNase-free 的超纯水中。

二：RT（逆转录）反应合成 cDNA

2. 按下表配制 RT 反应体系（20 μL 体系）:

RNA 模板

总 RNA < 5 μg

或 poly(A) mRNA

或随机引物(0.5 μg/μL) 1 μL

或自备模板专一反向引物(20 pmol/μL) 1-2 μL

RNase-free 水 补水到 13 μL

注意：RNA 样品不能含有基因组 DNA 污染。随机引物与 RNA 模板的比例将决定cDNA 合成的平均长度（成反比）。一般情况下随机引物效率好于 OligodT 引物，但如果只想转录总 RNA 中的 mRNA（只占 5%左右），则可优先选用 OligodT 引物，这样就可以排除非 mRNA 的干扰。

3. 轻轻混匀后离心 3-5 sec，反应混合物在 65℃温浴 5 min 后冰浴 30 sec，离心 3-5 sec。

将试管冰浴，再加入如下组分：

AMV RT Buffer（含 dNTP） 6 μL

AMV 逆转录酶（含 RI） 1 μL

轻轻混匀后离心 3-5 sec。

在 PCR 仪上按下列条件进行反转录反应：

cDNA 合成 42℃ 30-60 min；

终止反应 85℃ 5 min（酶失活），处理后，置于冰上放置。

注意：若使用 Oligo dT 引物或序列特异性引物，进行 42℃，30-60 min 反应； 若

使用随机引物，应先进行 25℃，10min 反应，然后进行 42℃，30-60 min 反应。

三、PCR（30 μL 体系）

4. 在 PCR 管中加入下列成分：

成分 加入量

PCR MagicMix 3.0，含染料 15 μL

cDNA 样品（上步的 RT 反应液） 1-5 μL

模板专一性正向引物(10 pmol/μL) 1-2 μL

模板专一性反向引物(10 pmol/μL) 1-2 μL

补水到 30 μL

注意：cDNA 也可以稀释后作 PCR 模板。是否稀释或稀释倍数取决于靶基因的丰度。

5. PCR 反应参数(需要根据模板和引物决定，下面的只做参考)：

过程 温度 时间

预变性 94℃ 5 min

PCR 反应

（35 个循环）

94℃ 1 min

55℃ 1 min

20191012ww

72℃ 2 min

后延伸 72℃ 10 min

四、电泳检测

取 5-10μL PCR 产物直接在 PAGE 或琼脂糖凝胶上电泳，跟分子量标准比较估计出扩增产物的大小。注：本试剂盒中的 PCR mix 含有甘油和染料，可以直接上样，不需要额外再加电泳上样液。