Ribo-SPIA cDNA扩增试剂盒

产品及特点 血液样品和各种临床样品（包括组织检查、FFPE 切片或少量细胞样品）都是基因表达分析和诊断的常见材料，但这些样品通常数量有限，质量不高，并且还没法进行第二次取样。所以得到足够 RNA 量供后续试验是一个非常棘手的瓶颈。为解决这一问题，本公司根据 Ribo-SPIA 技术，开发了本产品。Ribo-SPIA 技术的核心是利用 DNA/RNA 嵌合引物，以带 polyA 尾巴的 mRNA 为模板进行逆转录并得到双链 cDNA、RNase H 不间断地在 cDNA 第 1 链中的 RNA 部分产生裂口，DNA聚合酶以此裂口为基础进行链取代聚合反应，产生 cDNA 单链。此技术原理图如下：本产品具有下列特点：

1. 高效，能线性扩增 1000-10000 倍，能用 5-100 ng 总 RNA 模板扩增得到 5 ug

左右的单链 cDNA（扩增的 cDNA 主要来源于总 RNA 中的 mRNA）。

2. 步骤简单方便，扩增在恒温进行，只需要 4 个小时，不需要特殊仪器设备。

3. 保真性好，保持 RNA 样品中各分子的相对丰度。

4. 尤其适用于 RNA 产量和质量都不高的样品。

5. 扩增得到的单链 cDNA 能直接用于各种后续试验，包括 qPCR、芯片分析、杂交反应等。

6. 本产品足够做 10 次双链 cDNA 的合成，20 次 SPIA 扩增。
规格及成分 成 份 编 号 20 次塑料袋包装
cDNA 一链合成缓冲液 130308A 40 uL
MMLV 逆转录酶 60905 10 uL
cDNA 二链合成缓冲液，5× 130308B 160 uL
cDNA 二链合成酶混合液 20× 130308C 40 uL
SPIA RT 引物 Yw1193 40 uL
SPIA 反应液，5× 131083A 320 uL
SPIA 扩增引物 Yw1192 320 uL
SPIA 酶混合液 131083D 120 uL
超纯水 100935 1 mL
使用手册 1 份

运输及保存 低温运输，-20℃保存，有效期为 1 年。 

使用方法 一：样品 RNA 的制备

本产品不含 RNA 相关试剂，用于 Ribo-SPIA 扩增的每个批次的 RNA 样品好先做一个预实验。总 RNA 样品的浓度必须在 1-20ng/uL，一次 RIBO-SPIA 所需总 RNA 的量为 1ug。也可以使用 mRNA，一次 Ribo-SPIA 所需总 mRNA 的量为5-100 ng。过低则需要浓缩，过高则需要用无 RNase 的水稀释。RNA 必须经过DNase 处理，不能含 DNA 污染。微量提取时不能使用核酸类的助沉剂。注意：本产品只能扩增含带 polyA 尾巴的 RNA，不能扩增DNA 和不含 polyA 尾巴的 RNA。

二：一管式双链 cDNA 的合成

1. 在 0.5mL PCR 管中，按下表配制双链 cDNA 合成反应。注意：好每次实验设置一个阴性对照组，在此对照中用超纯水替代自备的 mRNA 或总 RNA:

成分 用量

自备 mRNA 或总 RNA

4 uL mRNA（5-100ng）

或 4 uL 总 RNA（1ug）

SPIA RT 引物 20uM 1 uL

65℃ 5 分钟后室温放置 2 分钟，短暂离心后放 4℃

cDNA 一链合成缓冲液 4 uL

MMLV 逆转录酶 1 uL

轻柔吹打混匀后得到 10uL 的反应体系。42℃保温 90 分钟合成

一链 cDNA。结束后 70℃保温 15 分使酶变性，后 4℃放

置，然后加入下列成分，得到 80uL 反应体系。

超纯水 50 uL

cDNA 二链合成缓冲液 16 uL

cDNA 二链合成酶混合液 4 uL

轻柔吹打混匀后，短暂离心，16℃保温 2 小时合成 cDNA 第二

链，然后 75℃ 15 分灭活酶，后 4℃放置待用

三：SPIA 扩增
2. 在 0.5mL PCR 管中，按下表配制 20uL 的 SPIA 反应体系。注意：好设置两个阴性对照组，在此两个对照中分别用超纯水替代 SPIA 引物和 cDNA 双链反应液。

成分 用量

cDNA 双链反应产物 40 uL(来于上步)

SPIA 扩增引物 10uM 16 uL

SPIA 反应液，5× 16 uL

超纯水 42 uL

94℃20 秒后 50℃放置复性待用

SPIA 酶混合液 6 uL

轻柔吹打混匀后得到 120 uL 反应体系，50℃扩增 60 分钟，

后 4℃放置

四：SPIA 扩增产物的检测

3. 取 5uL SPIA 扩增产物进行 PAGE 电泳检测。标准的反应结果是产生长度在200-2000bp 之间的产物。

4. 如果产物将用于 PCR 定量，则可以不经过纯化直接使用，如果需要用于芯片杂交和浓度测定，则需要按常规的方法纯化 cDNA 以便去除残留的 dNTP 和引物。

5. OD 检测纯度和浓度。在 OD260 的波长下测样品你给的光吸收。由于扩增产物是单链 DNA，故 1OD260=33ug/mL。

6. 所得 DNA 可以放-20℃长期放置。